实时定量RT-PCR检测各关键分子mRNA表达水平 与NC组比较,MS组CollagenⅠ/Ⅲ、TGF-β、ICAM-1、IL-6、TNF-α、IKKβ及NF-κB mRNA表达明显升高(P＜0.01);与MS组比较,HUDT组CollagenⅠ/Ⅲ、TGF-β、ICAM一1、IL-6、TNF-α、IKKβ及NF-κB

mRNA表达明显下降(P＜0.01～0.05)。 和 10.Western Blot检测各关键分子蛋白表达水平 与NC组比较,MS组大鼠心肌组织IκB蛋白降解增多(P＜0.01);与MS组比较,HLJDT组大鼠心肌组织IκB蛋白降解减少(P＜0.05)。 与NC组比较,MS组大鼠心肌组织总蛋白及核蛋白NF-κB P65水平均升高(P＜0.05);与MS组比较,HLJDT组大鼠心肌组织总蛋白及核蛋白NF-κB P65水平均降低(P＜0.05)。 与NC组比较,MS组大鼠心肌组织磷酸化JNK(pJNK)及丝氨酸磷酸化IRS-1(pIRS-1)蛋白水平明显升高(P＜0.01),Akt蛋白水平明显下降(P＜0.01)。与MS组比较,HLJDT组大鼠心肌组织pIRS-1蛋白水平明显降低(P＜0.05),Akt蛋白水平明显升高(P＜0.01),pJNK蛋白水平降低,但两组间无统计学意义(P＞0.05)。 与NC组及HLJDT组比较,MS组大鼠心肌组织非磷酸化JNK(JNK)及非磷酸化IRS-1(IRS-1)蛋白水平升高,但三组之间无统计学意义(P＞0.05)。 11.相关性分析结果 采用Pearson相关分析,结果显示血清IL-6及TNF-α水平分别与体重、动脉收缩压、空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数及胶原表达呈正相关(P＜0.01);与高密度脂蛋白表达呈负相关(P＜0.05)。 结论 1.通过高糖、高盐及高脂饮食喂养Wistar大鼠16周,成功建立了与人MS相似的大鼠模型,为MS发病机制研究提供了可靠的研究平台。

2.MS大鼠具有心肌细胞凋亡增多、室壁增厚、左室舒张功能下降及心肌间质纤维化等特点,证实MS大鼠出现心肌重构。 3.黄连解毒汤对MS大鼠心肌重构具有明显的干预作用。 4.MS大鼠心肌组织存在炎症诱导的IKK及JNK激活,并因其激活而抑制正常胰岛素信号传导,引起心肌结构与功能受损。 5.黄连解毒汤可通过抑制炎症反应,减少IKK激活,进而改善IR,起到干预MS心肌重构的作用。 背景 代谢综合征(Metaboic Syndrome,MS)是以中心型肥胖、糖代谢异常、高血压、血脂紊乱等多种代谢紊乱或危险因素聚集一体的临床症候群。MS加速了2型糖尿病及心血管疾病的发生并使其导致的死亡率逐渐上升。近年来,随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变以及不良的生活方式,代谢综合征发病率显著增长,据报道我国成人MS患病率为14%-18%。 MS中各组成成分都是心血管疾病发生的独立危险因素,合并的代谢异常组分越多,其对心血管疾病的协同危险作用越强,心血管疾病的发生率越高。MS患者发生冠心病及中风的危险性较正常人增加3倍,心血管死亡率也显著增加;而且,MS血管内皮功能障碍、动脉僵硬度增高以及血管内-中膜厚度增加,这些均为血管早期病变的指标,提示MS患者大血管结构和功能的改变可能是其心脑血管疾病发生发展的基础。因此,基于MS人群中心血管疾病的高风险性,深入研究MS患者血管重构的发生机制,有效减少心血管终点事件的发生至关重要。 Depsipeptide细胞系 随着对MS发病机制研究的进一步深入,炎症在以胰岛素抵抗(IR)为核心的MS中的作用越来越受到重视。许多研究证实MS及IR是一种慢性低水平的炎症状态。大量研究显示,MS的发生往往伴随着炎症因子水平的升高。许多大规模临床实验证实,炎性指标如CRP、TNF-α及IL-6等在MS患者血清中水平明显升高,提示CRP、TNF-α及IL-6等炎症因子在MS的发生发展中扮演了重要角色。 和 促炎症反应细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)等可激活p38MAPK。p38MAPKN路是1993年发现的一类新的MAPK通路,p38MAPK在各组织中广泛表达,一直作为炎症的信号传递者进行广泛的研究。目前很多研究发现p38MAPK信号传导通路与血管重构密切相关,并认为p38MAPK有可能成为血管重构的治疗靶点。

黄连解毒汤源于唐代王烹《外台秘要》,由黄连、黄柏、黄芩、栀子四味药组成,为清热解毒的代表方。研究已证实黄连解毒汤具有抗炎及改善IR的作用,进一步研究表明,黄连解毒汤降低心血管事件的发生率可能与其抗炎作用有关。 目前国内外研究中,对于MS大血管结构改变及其发生机制及干预研究的报道较少。本研究应用MS大鼠模型为研究对象,拟观察MS大鼠大血管结构和功能改变,探讨血管炎症反应对MS大血管重构的影响以及其可能机制,研究黄连解毒汤对MS大鼠血管炎症及大血管重构的干预效果,为有效逆转或延缓MS患者心血管损害提供重要的理论和实验依据。 目的 1.观察MS大鼠是否存在血管炎症反应及主动脉结构重构。 2.评价黄连解毒汤对MS大鼠血管重构的影响并探讨其可能的机制。 方法 雄性Wistar大鼠45只,随机分为两组:正常对照组(NC组,n=10),模型组(n=35)。NC组给予标准大鼠饲料及普通饮水喂养,模型组给予高糖、高脂及高盐饲料及20%高蔗糖水喂养(HF饮食)。HF饮食喂养16周后,将成模的21只大鼠随机分为代谢综合征组(MS组,n=10)及黄连解毒汤组(HLJDT组,n=11)。此后12周,MS组(n=10),继续给予HF饮食同时每天以生理盐水2ml灌胃;HLJDT组(黄连解毒汤组,n=11),继续给予HF饮食同时每天以黄连解毒汤1.04g/100g灌胃;NC组(n=10),每天以生理盐水2ml灌胃。 实验过程中,进行以下检测:(1)整个实验过程中,每2周称量体重及测尾静脉血压1次;(2)分别于造模前、喂养16周、实验末抽取静脉血测定空腹血糖、空腹胰岛素、血脂(甘油三酯、胆固醇,高、低密度脂蛋白),血清IL-6及TNF-α水平并计算胰岛素抵抗指数(IRI)。 实验结束时处死动物,留取血管标本,进行下列实验:(1)主动脉病理学检查;(2)免疫组织化学检测主动脉ICAM-1及VCAM-1;(3)实时定量RT-PCR法检测主动脉MMP-2、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、TNF-αmRNA表达;(4)WesternBlot法检测主动脉磷酸化p38MAPK、磷酸化ATF-2及MMP-2蛋白表达。 结果 1.

01)。 结论：腺病毒介导的mda-7能在体外活体中高表达；Ad.mda-7和ADM治疗裸鼠肝癌具有协同作用，Ad.mda-7可显著增强化疗效果，明显降低化疗不良反应。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)三肽序列是多种细胞外基质(Extracellular HIF-1 cancer matrices,ECM)蛋白和血浆蛋白结构中保守的共有的基本成分,是广泛存在于细胞间识别系统的基本单位,许多病理学过程与不正常的ECM作用相关,因此含RGD的多肽或化合物有望成为治疗一些重要疾病的新制剂。同时,该类肽的粘附性也成为药物设计的一个新靶点。本论文研究内容主要包含两个部分: 一、酶法与化学法合成细胞粘附肽RGDS 目前,关于RGD的合成报道中酶法合成RGD的报道很少。我们首次采取酶法化学法相结合的方式合成了RGDS四肽。这种方法具有反应条件温和,合成产率高等优点,从而建立一条高效廉价的RGD(S)的合成路线。 二、RGDS对肿瘤细胞增殖及其凋亡的影响 本文研究了RGDS对人胃癌细胞系BGC-823的生长增殖及凋亡的影响。通过MTT试验检测细胞活力,发现RGDS能够抑制细胞的生长。进一步对细胞形态的观察了解到RGDS之所以能够抑制人胃癌细胞系BGC-823的生长是由于诱导细胞发生了凋亡,我们通过流式细胞仪检测;DNA电泳来进一步证实,并对RGDS的浓度关系进行了探讨。为探讨其诱导凋亡的分子机制,我们通过免疫组化方法显示了细胞内的抗凋亡蛋白Survivin在RGDS的作用下阳性率显著降低。
第一部分美满霉素抑制脂多糖诱导的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶的表达

目的在离体细胞培养中，探讨美满霉素(Minocycline,MC)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的BV-2细胞一氧化氮(nitric oxide,NO)产生及诱导型一氧化氮合酶(Induced nitricoxide synthase,iNOS)表达的影响。方法将MC或LPS加入培养的BV-2细胞中，使用酶法测定培养上清中的NO的浓度，免疫组织化学方法观察BV-2细胞中iNOS蛋白的表达，逆转录聚合酶链式反应检测细胞iNOS mRNA表达。结果LPS(100ng／ml)组BV-2细胞培养上清中的NO含量显著升高(P＜0.05)，iNOS蛋白和mRNA的表达也显著升高(均P＜0.01)，高于空白对照组。MC(10μmol／L)预处理可明显抑制上述变化。MC+LPS组BV-2细胞培养上清中NO含量，细胞中iNOS蛋白、mRNA的表达较LPS组显著下降(均P＜0.01)，但仍显著高于空白对照组(均P＜0.05)。结论MC预处理可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞iNOS的表达及NO产生。

第二部分美满霉素抑制脂多糖诱导的小胶质细胞肿瘤坏死因子-α的表达 目的在离体细胞培养中，探讨MC对LPS诱导的BV-2细胞肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)表达的影响。方法将MC或LPS加入培养的BV-2细胞中，使用酶联免疫吸附试验(Enzyme 没有 linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫组织化学方法观察BV-2细胞中TNF-α蛋白的表达，逆转录聚合酶链式反应检测细胞TNF-αmRNA表达。结果LPS(100ng／ml)组BV-2细胞培养上清中的TNF-α含量显著升高(P＜0.01)、细胞中TNF-α蛋白和mRNA的表达也显著升高(均P＜0.01)，高于空白对照组。MC(10μmol／L)预处理可明显抑制上述变化。MC+LPS组BV-2细胞培养上清中TNF-α含量较LPS组显著下降(P＜0.01)，与空白对照组比较无差异(P＞0.05)。MC+LPS组BV-2细胞中TNF-α蛋白、mRNA的表达较LPS组显著下降(均P＜0.01)，但仍显著高于空白对照组(均P＜0.05)。结论MC预处理可显著抑制LPS诱导的小胶质细胞TNF-α的表达。 第三部分美满霉素下调P38MAPK的表达抑制脂多糖诱导的小胶质细胞的活化 目的在离体细胞培养中，探讨MC抑制LPS诱导的BV-2细胞活化与P38MAPK信号传导途径的关系。方法将MC或LPS加入培养的BV-2细胞中，利用Western免疫印迹法观察BV2细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，P38MAPK)表达的变化。结果实验各组BV-2细胞P38MAPK总蛋白水平无变化；空白对照组、MC组几乎无磷酸化P38MAPK(P-PMAPK)蛋白的表达；LPS组P-PMAPK蛋白表达水平显著上调，与空白对照组有显著差异(P＜0.01)；MC+LPS组BV-2细胞中P-PMAPK蛋白表达水平较LPS组显著下降(P＜0.01)，但仍显著高于空白对照组(均P＜0.01)。结论MC可能通过下调P38MAPK信号途径的活性抑制LPS诱导的小胶质细胞的激活。 已经 第四部分美满霉素对MPP~+诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的在离体细胞培养中，探讨MC对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP~+)诱导的帕金森病细胞凋亡模型的保护作用并探讨其机制。方法将MC或MPP~+加入培养的PC12细胞中，建立多巴胺神经元凋亡模型，四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞代谢活性，电泳法检测细胞凋亡，流式细胞术检测细胞凋亡率，逆转录聚合酶链式反应分别检测细胞Caspase-3 mRNA表达。结果MPP~+浓度为10μmol／L时，建立多巴胺神经元凋亡模型。MC100μmol／L预处理可明显升高MPP~+处理的PC12细胞的细胞活性。MC+MPP~+处理组细胞凋亡率显著低于MPP~+处理组(P＜0.01)，但仍明显高于空白对照组(P＜0.05)。MC+MPP~+组细胞Caspase-3 mRNA表达明显低于MPP~+组(P＜0.01)，仍明显高于空白对照组(P＜0.05)。结论MC对MPP~+诱导的细胞凋亡有一定的保护作用，MC可能通过下调Caspase-3 mRNA表达保护MPP~+诱导的细胞凋亡。
第一部分 血红素氧合酶和内源性一氧化碳在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的作用 目的:通过妊娠期高血压疾病孕妇胎盘组织中血红素氧合酶的表达和内源性CO含量测定,探讨血红素氧合酶/一氧化碳系统在妊娠期高血压疾病发病中的作用机制。 方法:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例妊娠期高血压疾病患者组(HDCP组)和15例正常晚孕妇女(对照组)胎盘组织中HO-1、HO-2mRNA的表达;HE染色观察胎盘绒毛及血管病变;免疫组化染色法检测胎盘组织中HO-1、HO-2的定位和表达,采用高清晰度彩色医学图文分析系统对其定量分析;分光光度法测定胎盘组织中HO的活性;Western blot检测胎盘组织中HO-1、HO-2蛋白质的表达;双波长定量测定法检测胎盘组织匀浆上清液碳氧血红蛋白(COHb)含量;硝酸还原酶法测定胎盘组织中NO代谢产物亚硝酸基/亚硝基(NO2-/NO3-)。 结果:(1)HE染色可见妊娠期高血压疾病组胎盘绒毛数目减少、排列紊乱、细小血管壁增厚和管壁纤维素样坏死发生率显著高于正常妊娠组(P<0.

01),在术后8h达最高水平,术后各时间点E组大鼠脊髓TNF-α表达水平明显低于C组(P﹤0.01)。 结论在大鼠切口疼痛模型中,手术刺激后,大鼠活动频繁,出现术侧足翘起、跛行、舔咬伤口等异常行为,CPS升高,机械性痛阈和热痛阈下降,这些异常表现在术后4～16h表现明显,与临床上手术后患者疼痛状态接近;手术后大鼠脊髓TNF-αmRNA和蛋白表达升高,在术后4～16h维持在较高水平,大鼠脊髓TNF-α参与了手术后疼痛的产生和维持。

第二部分鞘内注射TNF-α对大鼠痛阈的影响 目的观察鞘内注射不同剂量的TNF-α蛋白对大鼠机械痛阈和热痛阈的影响。 方法健康成年雄性SD大鼠24只,随机分为4组,每组6只。对照组(C组):鞘内注射生理盐水10μl;TNF-α1组(T1组):鞘内注射TNF-α1ng(10μl);TNF-α5组(T5组):鞘内注射TNF-α5ng(10μl);TNF-α10组(T10组):鞘内注射TNF-α10ng(10μl)。腹腔注射1%戊巴比妥钠40mg/㎏麻醉大鼠后,大鼠取俯卧位,垫高下腹部以充分显露大鼠腰椎间隙,用微量注射器(25μl)于L5～L6间隙直接穿刺注射给药(生理盐水和不同剂量的重组大鼠TNF-蛋白),鞘内注射后-1(鞘内注射前1h)、4、8、16和24h用Dynamic 而且 Plantar Aesthesiometer和Plantar test 7375分别测定大鼠机械性痛阈和热痛阈。 结果(1)四组大鼠鞘内注射前机械性痛阈比较无明显差异(P﹥0.05)。鞘内注射生理盐水后,对照组大鼠机械性痛阈无明显变化(P﹥0.05)。鞘内注射rrTNF-α后4～8h,试验组各组大鼠机械性痛阈下降(P﹤0.05或P﹤0.01);鞘内注射rrTNF-α后16h, TNF-α5组和TNF-α10组大鼠机械性痛阈下降(P﹤0.05或P﹤0.01);鞘内注射rrTNF-α后24h, TNF-α10组大鼠机械性痛阈下降(P﹤0.05)。(2)四组大鼠鞘内注射前热痛阈比较无明显差异(P﹥0.05)。鞘内注射生理盐水后,对照组大鼠热痛阈无明显变化(P﹥0.05)。鞘内注射rrTNF-α后4～16h,试验组各组大鼠热痛阈下降(P﹤0.05或P﹤0.01);鞘内注射rrTNF-α后24h, TNF-α10组大鼠热痛阈下降(P﹤0.05)。 结论鞘内注射TNF-α可导致中枢痛觉过敏,使大鼠机械性痛阈和热痛阈降低,随着注射剂量增加,机械痛阈和热痛阈下降幅度增加并且维持时间延长。 第三部分切口痛大鼠脊髓磷酸化p38MAPK的变化 目的观察切口疼痛模型中,大鼠疼痛行为学、痛阈和脊髓p38MAPK的变化。 方法健康成年雄性SD大鼠90只,随机分为三组:对照组(C组)、二甲基亚砜组(D组)和SB203580组(S组),每组30只。戊巴比妥钠麻醉大鼠后,在大鼠左后爪足底实施手术刺激;然后对C组大鼠鞘内注射生理盐水10μl,对D组大鼠鞘内注射2%二甲基亚砜10μl,对S组大鼠鞘内注射p38MAPK特异性抑制剂SB203580(溶于2%二甲基亚砜)10μg(10μl)。按照手术切割刺激后-1、4、8、16和24h时间点随机分配大鼠,每组每一时间点6只。手术切割刺激后-1(术前1h)、4、8、16和24h观察大鼠行为学变化;用Dynamic

ABT-263分子重量 Plantar Aesthesiometer和Plantar test 7375分别测定大鼠机械性痛阈和热痛阈;用Western Blot方法测定脊髓p38MAPK和磷酸化p38MAPK的表达。 结果(1)手术后三组大鼠活动频繁,出现跛行、舔咬左后爪足底等行为,左后爪常翘起,即使着地也极少负重,对照组(C组)和二甲基亚砜组(D组)大鼠表现无差异,SB203580组(S组)大鼠轻于C组和D组大鼠。三组大鼠术前(-1h)累积疼痛评分(CPS)均为0,手术后三组大鼠CPS升高(P﹤0.01),C组和D组大鼠CPS无明显差异(P﹥0.05),S组大鼠CPS低于C组和D组(P﹤0.01),三组大鼠CPS均在术后8h时最高。(2)三组大鼠术前(-1h观察时间点)机械性痛阈(HWMT)比较无明显差异(P﹥0.05)。手术后三组大鼠HWMT均下降(P﹤0.01),C组和D组大鼠HWMT无明显差异(P﹥0.05),S组大鼠HWMT高于C组和D组(P﹤0.01),三组大鼠HWMT均在术后8h时最低。(3)三组大鼠术前(-1h)热痛阈(HWTL)比较无明显差异(P﹥0.05)。手术后三组大鼠HWTL均下降(P﹤0.01),C组和D组大鼠HWTL无明显差异(P﹥0.05),S组大鼠HWTL高于C组和D组(P﹤0.01),三组大鼠HWTL均在术后8h时最低。(4)三组大鼠术前(-1h观察时间点)脊髓中p38MAPK有一定程度的表达,P-p38MAPK几乎检测不到。手术后三组大鼠p38MAPK无明显变化(P﹥0.05);P-p38MAPK表达水平上升,C组和D组大鼠CPS无明显差异(P﹥0.05),S组大鼠低于C组和D组(P﹤0.01),三组大鼠均在术后8h时最高(P﹤0.01)。

selleck screening library 结论在大鼠切口疼痛模型中,手术刺激后,大鼠活动频繁,出现术侧足翘起、跛行、舔咬伤口等异常行为,累积疼痛评分升高,机械性痛阈和热痛阈下降,这些异常表现在术后4～16h表现明显,与临床上手术后患者疼痛状态接近;手术后大鼠脊髓p38MAPK磷酸化水平升高,在术后8h达最高水平,大鼠脊髓p38MAPK信号传递途径参与了手术后疼痛的产生和维持。 第四部分鞘内注射沙利度胺和SB203580对切口痛大鼠的影响 目的观察鞘内注射沙利度胺和SB203580后,切口痛大鼠行为学、疼痛阈值和脊髓TNF-α、p38MAPK及磷酸化p38MAPK的变化。 方法90只健康成年雄性SD大鼠,随机分为三组:对照组(C组)、沙利度胺组(T组)和SB203580组(S组),每组30只。戊巴比妥钠麻醉大鼠后,对大鼠左后爪足底实施手术刺激。术后C组大鼠鞘内注射生理盐水10μl,T组鞘内注射沙利度胺100μg(10μl),S组鞘内注射SB203580(溶于2%二甲基亚砜)10μg(10μl)。按照术后-1(术前1h)4、8、16和24h随机分配大鼠,每组每一时间点6只。在上述时间点观察每组大鼠行为学变化;用Dynamic Plantar Aesthesiometer和Plantar test 7375分别测定大鼠机械性痛阈和热痛阈;用RT-PCR方法测定腰段脊髓TNF-αmRNA表达和用Western Blot方法测定脊髓TNF-α蛋白、p38MAPK及P-p38MAPK的表达。 结果(1)三组大鼠术前活动无异常,术后活动频繁,出现跛行、舔咬手术切口等行为,C组大鼠表现更明显。三组大鼠术前(-1h时间点)累积疼痛评分(CPS)均为0,术后三组大鼠CPS升高(P﹤0.01),术后8h最高;术后各时间点比较, T组和S组CPS均低于C组(P﹤0.05或P﹤0.01)。(2)三组大鼠术前(-1h时间点)机械性痛阈(HWMT)比较无明显差异(P﹥0.05)。术后各组大鼠HWMT下降(P﹤0.01),但T组和S组在术后各时间点均高于C组(P﹤0.05或P﹤0.

05),AKF-PD和DEX预处理HK-2细胞后能够显著抑制NF-κB报告基因的激活(p
第一部分：水通道蛋白-4敲除对小鼠海马依赖性学习记忆和突触可塑性的影响 目的：在中枢神经系统,星形胶质细胞参与调节神经元的活性及功能,并在信号传导和处理、突触可塑性以及学习记忆等方面发挥重要的作用。水通道蛋白-4(aquaporins-4,

AQP-4)为水通道蛋白家族的一种,广泛分布在中枢神经系统,并主要表达于星形胶质细胞膜。AQP-4在调节水稳态、细胞微环境以及脑体积等方面均发挥着重要的作用。此外,研究表明AQP-4也参与调节星形胶质细胞的功能。但是目前就AQP-4是否参与调节海马区突触可塑性以及相关学习记忆的研究甚少。因此,本文以AQP-4基因敲除鼠(knockout, KO)为研究对象,探讨AQP-4敲除对中枢神经系统中海马区的突触可塑性以及海马区依赖的学习记忆的影响及机制。 方法：采用急性离体脑片胞外场电位记录和脑片钳记录的方法分别记录AQP-4野生型(wild type, WT)小鼠和KO小鼠海马区CA3-CA1通路的场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potentials, fEPSPs)和兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents, EPSCs);采用新物体认知(novel object recognition, NOR)和条件恐惧记忆(fear conditioning)行为学实验观察AQP-4敲除对小鼠海马区依赖的学习记忆以及相关情感记忆行为的影响。电生理结果采用双因素方差分析(ANOVA)结合Bonferroni Alisertib post hoc test检验分析,行为学实验结果采用单因素方差分析(ANOVA)结合Student’s test检验分析方法。 结果：AQP-4敲除损伤海马区依赖的新物体认知能力,在训练后90min和24h检测发现AQP-4KO鼠探索新物体时间显著减少,认知指数较AQP-4WT鼠显著下降。此外,在条件恐惧行为学实验中,与WT鼠相比,KO鼠在恐惧记忆遗忘训练后24h、72h和120h时间点僵直率显著下降,但AQP-4敲除不影响小鼠痛阈。AQP-4敲除易化CA3-CA1通路的长时程抑制(long-term

BIBF 1120研究购买 depression, LTD),但不影响其基础突触功能和传递；AQP-4敲除引起的突触可塑性改变涉及突触后机制。AQP-4敲除易化NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)依赖的LTD (NMDAR-dependent LTD),不影响代谢性谷氨酸受体依赖的LTD (mGluR-dependent LTD)。此外,AQP-4敲除可选择性地增加NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(EPSCs),不改变AMPA受体(a-mino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate receptor, AMPAR)介导的EPSCs幅度。 结论：AQP-4敲除损伤小鼠海马区依赖的新物体认知能力,促进恐惧记忆的消散,易化海马区CA3-CA1通路NMDA受体依赖的LTD。 第二部分：突触和突触外NMDA受体在水通道蛋白-4敲除所致小鼠学习记忆和突触可塑性改变中的作用 目的：突触可塑性是学习记忆的分子生物学基础,其主要表现形式是LTP和LTD。大量研究表明,LTP与学习记忆的获得和形成相关,而LTD与学习记忆的整合和遗忘相关。海马区NMDA受体是参与调节突触可塑性和学习记忆的核心分子,其不同亚型在调节突触可塑性和学习记忆过程中发挥着不同的作用。NMDA受体除了表达于突触后致密区(postsynaptic

density, PSD),还分布于突触前膜以及PSD的周围或非突触膜上。其中位于突触外的NR2B-NMDA受体参与调节LTD的产生,而位于突触的NR2A-NMDA受体则参与调节LTP的诱发。因此,本实验研究突触和突触外NMDA受体在AQP-4敲除所诱导的海马区依赖突触可塑性和学习记忆行为变化中的作用和机制。 和 方法：采用急性离体脑片胞外场电位记录和脑片钳记录的方法研究NR2A-NMDA受体和NR2B-NMDA受体对小鼠海马LTD的影响和机制,并采用新物体认知行为学实验和条件恐惧记忆行为学实验观察NR2A-NMDA受体和NR2B-NMDA受体在AQP-4敲除所导致的小鼠海马区依赖的学习记忆行为改变中的作用和机制。电生理结果采用双因素方差分析(ANOVA)结合Bonferroni post hoc test检验分析,行为学实验结果采用单因素方差分析(ANOVA)结合Student’s test检验分析方法。 结果：AQP-4敲除易化LTD为NR2B-NMDA受体依赖的LTD, NR2B受体选择性阻断剂ifenprodil (3μM和Ro256981(1uM)阻断AQP-4WT小鼠和KO小鼠LTD的诱发,NR2A受体选择性抑制剂PEAQX (0.4μM)无上述作用。突触外NR2B受体阻断剂HA966(500μM)拮抗AQP-4KO对LTD的易化作用。AQP-4KO选择性增加NR2B-NMDA受体介导的EPSCs。行为学实验发现,NR2B-NMDAR参与AQP-4KO所引起的新物体认知能力损伤,NR2A-NMDAR则无此作用。在遗忘训练前给予NR2B-NMDA受体阻断剂ifenprodil (3mg/kg)和突触外NR2B受体阻断剂HA966(2.

0完成。与常数项比较,采用单样本t检验；两样本均数的比较采用两独立样本t检验。p<0.05)；RT-PCR结果显示,与sham组大鼠比较,肾性高血压大鼠AT1R的mRNA水平也是显著升高(P<0.05),显著的抑制血浆NE水平(P<0.05),只有脑室内注射losartan可以降低Ras-GTP的表达(P<0.05),而p38的抑制剂SB203580、caspase-3的抑制剂Z-DEVD-FMK不能提高Bcl-2的表达(P
研究背景

什么 动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CAD)的主要病理基础。也是心血管系统疾病中最常见的疾病,严重危害人类健康,而AS的发病机制至今尚未明确。随着动脉粥样硬化研究的不断深入,人们逐渐认识到炎症反应是AS发生、发展过程的的病理基础。抗炎治疗是防治AS相关疾病的重要策略之一。 内脏脂肪素(visfatin)是新发现的一种脂肪细胞因子,已有研究visfatin通过促炎症反应在AS的发生和发展中起重要作用。临床研究显示,冠心病患者血浆的visfatin的升高伴有白介素-6(interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a)等炎症介质的升高。且研究发现2型糖尿病患者的血浆visfatin水平与血管内皮细胞功能成显著负相关,而众所周知血管内皮损伤是AS发生的始动环节之一,从起始环节干预AS的形成,保护血管内皮免受各种炎症因子的作用,是抗AS发生的关键。 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一类存在于真核细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶。MAPK包括了3种主要的亚家族：SAPK/JNK(stress-activated protein kinases/c-Jun NH2-terminal kinases)、 ERKl/2(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)和p38分裂原激活蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)。其中P38MAPK和JNK通路主要对炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号进行传导,与细胞分化、细胞凋亡、应激反应密切相关。且已有研究已表明P38MAPK、JNK通路均参与了AS的病理过程。本研究旨在探讨Visfatin是否受P38MAPK、JNK信号分子的调节诱导HUVEC损伤从而参与AS炎症反应。 定心方(Dingxin Recipe, DXR)由丹参、三七、赤芍、瓜萎、茯苓、党参、灵芝、酸枣仁、苦参、黄连等组成,具有益气活血祛痰燥湿之功效,临床研究证明其对冠心病有良好的疗效,其对缺血及再灌注过程的炎症激活有显著的抑制作用同时降低缺血再灌注损伤大鼠JNK和P38MAPK蛋白的表达,增强ERK蛋白的表达来。本论文要探讨定心方是否受P38MAPK和JNK信号通路调控发挥保护由visfatin诱导损伤的HUVEC,从而起到抗AS的作用。

第一章visfatin对HUVEC增殖抑制及定心方含药血清的干预 目的： 不同浓度及时间visfatin对HUVEC增殖影响 不同浓度及时间DXR含药血清对HUVEC增殖影响 DXR含药血清对visfatin抑制的HUVEC的增殖影响 方法及分组： GSK1120212半抑制浓度 定心方含药血清的制备：60只雄性SD大鼠,体重200-250g,随机分为2组,每组30只,分别灌服定心方水煎剂和等体积生理盐水。定心方给药剂量为18.59g/kg/d,每日药量分两次灌胃,连续7d。末次给药前,禁食不禁水12h,末次给药2h后行10%水合氯醛(4ml/kg)麻醉,腹主动脉采血。血标本4℃静置4h,3500r/min离心10min,分离血清,0.22μ.m微孔滤膜过滤除菌,56℃灭活30mmin,每只大鼠血清单独分装,-80℃保存备用。

Visfatin浓度组：分别用0、50、100、200μg/Lvisfatin处理HUVEC24h。 Visfatin时间组：以100μg/L visfatin分别处理HUVEC0、6、12、24、48h。 DXR含药血清浓度组：将提出的含药血清分别稀释为0、0.25%、0.5%、1%、2%、5%、10%、20%DXR含药血清加入HUVEC作用24h。 并且 DXR含药血清时间组：用0.5%DXR含药血清分别作用0、6、12、24、48h。 DXR含药血清及相关的通路抑制剂预处理细胞分组：P38MAPK通路分组：①正常对照组；②Visfatin+SB203580:SB203580(终浓度为10μmol/L)预孵育细胞30min,加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h；③Visfatin+DXR药物血清组：加入5%DXR药物血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h；④Visfatin组：加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h；⑤Visfatin+空白血清组：加入5%空白血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L Visfatin刺激24h。 JNK通路分组：①对照组；②visfatin+DXR药物血清组：加入5%DXR药物血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L的Visfatin刺激24h；③Visfatin+空白血清组：加入5%空白血清预孵育1h,加入终浓度为100μg/L的Visfatin刺激24h；④visfatin组：加入visfatin100μg/L刺激24h；⑤visfatin+SP600125组：加入SP600125(终浓度为10μmol/L)预处理细胞30min,再给予visfatin100μg/L刺激24h。 MTT比色法测定HUVEC的增殖：将HUVEC接种于九十六孔板,按实验分组给予相应的处理因素后,每组设6个复孔。按MTT法具体操作步骤进行操作,在酶标仪490nm处测其OD值。 结果： 1.不同浓度及时间的Visfatin对HUVEC增殖的影响 与对照组比,50μg/Lvisfatin作用24h对HUVEC增殖无显著抑制作用,100、200μg/L visfatin作用24h抑制]HUVEC增殖具有显著性(P<0.05或P<0.01),经统计学处理组间差异无显著性。与对照组比,5%DXR含药血清作用6、12h对HUVEC的增殖无显著性影响；5%DXR含药血清作用24、48h均能显著性的增强细胞的增殖(P<0.01)；与visfatin组比,5%DXR含药血清、SB203580、SP600125作用24h可以增强由visfatin损伤的HUVEC增殖(P<0.05或P<0.01)；与visfatin组比,DXR药物血清、SB203580、SP600125均可显著性的抑制由visfatin诱导的IL-6和TNF-a表达(P<0.05或P<0.05或P<0.

2）。分别在指定时间点测量每组大鼠PaO2、PaCO2以及肺组织炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量、支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞计数、肺血管通透性、肺组织湿/干重比值（W/D）、肺组织HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA含量。另外，分别用海水（1300mOsm/kgH2O）、高渗山梨醇溶液（1300mOsm/kgH2O）、高渗白蛋白溶液（1300mOsm/kgH2O）和双蒸水（0mOsm/kgH2O）处理NR8383细胞，各组溶液保持相同的温度（25℃）和pH值（8.2），观察不同渗透压梯度和时间点下NR8383细胞HIF-1α蛋白和mRNA含量变化，并观察缺氧和高渗联合作用对上述细胞HIF-1α蛋白和mRNA含量变化的影响。此外，应用ATM、PI3K、p38的抑制剂KU55933、LY294002、SB203580及CHX研究高渗调节HIF-1α表达的可能机制。最后，应用HIF-1α的小干扰RNA技术和测量单层细胞通透性的方法研究高渗环境下HIF-1α在炎症反应和肺血管通透性调节中的作用。

无 结果：用高渗液体（海水和高渗山梨醇）气管内滴入组大鼠肺组织缺氧、炎症因子水平、肺血管通透性、肺水肿都明显高于用等渗和低渗液体（等渗海水、等渗山梨醇和淡水）滴入组，同时伴有HIF-1α和VEGF蛋白及mRNA含量的明显增加。在NR8383细胞上证明了是海水中的高渗因素而不是离子、温度、pH值等其它因素导致的HIF-1α蛋白和mRNA含量的增加；同时，发现高渗和缺氧可以协同作用增加HIF-1α蛋白。此外，实验表明高渗通过增加ATM和PI3K的磷酸化水平上调了HIF-1α mRNA的表达进而使HIF-1α蛋白含量增加，并且通过增加p38的磷酸化水平抑制了HIF-1α蛋白的降解进而使可检测到的HIF-1α蛋白含量增加。最后，我们验证了高渗环境下HIF-1α促进NR8383细胞产生炎症因子，同时HIF-1α通过增加VEGF蛋白表达使RLMVEC单层细胞通透性增加。

结论：海水淹溺导致的肺部高渗和缺氧环境协同增加了肺组织HIF-1α表达，增加了的HIF-1α通过提高肺组织炎症因子水平和肺血管通透性进而加重了肺部炎症反应和肺水肿。
研究背景： 海水淹溺是航海、海上作战、作业时常发生的意外伤害事故，吸入海水可导致肺泡-毛细血管膜损伤并伴有通透性增高，富含蛋白的液体聚集于肺泡腔，引起海水淹溺型肺水肿(pulmonary edema induced by seawaterdrowning，PE-SWD)，是海水淹溺引起死亡的主要原因之一。PE-SWD的主要病理变化是肺通透性增高，肺水肿形成，引起低氧血症和呼吸困难。如不及时救治和控制病情，易发展为海水型呼吸窘迫综合征(seawaterrespiratory BMS-387032体内 distress syndrome, SW-RDS)。SW-RDS是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)的一种。近年来关于PE-SWD/SW-RDS的研究逐渐增多，但是其发病机制仍不完全清楚，缺乏有效的治疗手段，死亡率仍很高。PE-SWD/SW-RDS时，肺泡上皮屏障功能破坏，肺水肿液的清除功能障碍，加之吸入的高渗海水在肺泡内聚集，驱使血管内液体沿渗透压力梯度流向肺泡内，加重缺氧。 缝隙连接蛋白43(connexin43，Cx43)在肺泡上皮和毛细血管内皮普遍存在，是细胞间缝隙连接的基本组成单位，不仅发挥细胞间的通讯功能，而且对细胞的生长、分化和凋亡甚至肿瘤形成都有重要作用。有文献报道Cx43与血管通透性有关。近年来研究表明Cx43参与肺损伤的过程，但Cx43在PE-SWD/SW-RDS中的作用及其机制尚不清楚。本实验通过复制大鼠海水淹溺型肺水肿的模型，观察Cx43在海水淹溺型肺水肿中的作用，并进一步研究其可能的作用机制。 实验目的： ⑴观察大鼠海水淹溺型肺水肿模型中Cx43的表达变化。

⑵探讨Cx43在海水淹溺型肺水肿中的作用及其机制。 实验方法： 实验一 体内实验 24只SD大鼠随机分为4组，正常对照组(0h)、海水淹溺1h组(1h)、4h组(4h)和8h组(8h)。气管内滴注海水的方法复制大鼠海水淹溺型肺水肿的模型，通过肺组织湿干重比值(W/D)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量和伊文思蓝漏出指数(ELI)测定肺组织的通透性；RT-PCR和Western Blot等分子生物学实验方法检测肺组织Cx43的含量变化。 体外实验 采用25%体积浓度的海水孵育A549细胞模拟海水淹溺的肺内环境(作用时间为4小时)，观察Cx43的表达变化。A549细胞随机分为2组：空白对照组(Control)、海水组(SW)，通过RT-PCR和Western 为什么 Blot方法检测海水对Cx43的表达的影响。通过对FITC标记的葡聚糖的相对通透性测定单层A549细胞的通透性，观察海水对单层细胞通透性的影响。 实验二 (一)A549细胞随机分为空白对照组(Control)和海水组(SW)，WesternBlot方法检测海水对MAPK信号通路的作用。 (二)分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞随机分为5组：空白对照组(Control)、海水组(SW)、ERK1/2抑制剂组(PD)、JNK抑制剂组(SP)、p38抑制剂组(SB)，并设阴性对照组。通过FCM分析细胞膜Cx43的表达量。 (三)A549细胞随机分为6组：空白对照组(Control)、海水组(SW)、ERK1/2抑制剂组(PD)、JNK抑制剂组(SP)、p38抑制剂组(SB)和反义寡核苷酸干预组(ASODN)。通过Western Blot方法检测各组细胞Cx43的表达含量。培养单层细胞，通过对FITC标记的葡聚糖的通透性的检测观察单层细胞的通透性，统计分析Cx43含量与单层细胞通透性的关系。 实验结果： 实验一 体内实验 大鼠吸入海水后，肺组织W/D比值增加，BALF中的蛋白含量和ELI也明显增加(P<0.

程序性坏死抑制剂抗芥子气损伤作用评价 程序性坏死是近年来发现的一种由死亡受体介导的caspases非依赖性细胞死亡模式，在凋亡被抑制的情况仍可介导细胞坏死，其在炎症性病变、缺血性心脑血管病、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展及肿瘤细胞的耐药方面具有重要意义。DNA烷基化损伤可诱导细胞程序性坏死。而关于程序性坏死是否参与了芥子气诱导的细胞损伤目前尚无报道。本研究首次进行了程序性坏死抑制剂抗芥子气损伤作用的研究。 3.1程序性坏死抑制剂对染毒HaCaT细胞存活的影响 采用芥子气染毒HaCaT细胞模型，同时加入凋亡抑制剂z-VAD-fmk阻断细胞凋亡，观察程序性坏死抑制剂Nec-1对细胞存活的影响。结果表明，Nec-1、z-VAD-fmk单用时对芥子气所致HaCat细胞死亡具有明显保护作用，两者合用时对细胞的保护作用明显增强，细胞存活率接近100%。提示，程序性坏死参与芥子气诱导细胞死亡。 3.2程序性坏死抑制剂对芥子气染毒小鼠耳郭肿胀的影响 进一步，对程序性坏死抑制剂抗芥子气所致皮肤损伤的作用进行评价。结果表明，染毒前腹腔注射给予Nec-1（4mg/kg）和z-VAD-fmk（10mg/kg）对染毒耳肿胀均无明显影响。

4.免疫抑制剂抗芥子气损伤的药效评价 FTY720可通过降低外周血淋巴细胞数从而降低机体免疫反应，目前其治疗肾移植排斥反应已进入Ⅲ期临床研究阶段，对类风湿性关节炎模型的改善作用也已取得初步疗效。本研究采用小鼠芥子气耳郭皮肤染毒模型，考察了S1P抑制剂FTY720对芥子气染毒小鼠皮肤损伤的影响。结果表明，提前3天按1mg/kg/d连续灌胃给予FTY720对芥子气染毒小鼠耳郭肿胀无明显影响。 5.中药制剂抗芥子气损伤的药效评价 七叶皂苷钠具有抗炎抗渗出的作用，并可促进体内皮质醇类化合物的分泌。结果表明，七叶皂苷钠凝胶涂抹给药及腹腔注射给药（5mg/kg）对芥子气染毒小鼠耳郭肿胀均无明显影响。 三、抗炎药物与其他药物合用抗芥子气损伤的药效评价 芥子气损伤机制复杂，单一药物的疗效有限，因此，为提高治疗效果，需要针对不同的损伤机制采用联合用药和综合性治疗措施。聚(ADP-核糖)聚合酶（Poly(ADP-ribose)polymerase，PARP）是目前外军认为最有前景的抗芥子气损伤的治疗靶点。本课题进一步考察了抗炎药物与PARP抑制剂合用对抗芥子气损伤的保护作用。 high throughput screening selleck screening library 1.吲哚美辛与PRAP抑制剂合用对小鼠耳郭染毒模型的影响 染毒前给予非甾体抗炎药吲哚美辛（10mg/kg，po）和PARP抑制剂MUS003（200mg/kg，ip），考察两者合用对芥子气染毒皮肤损伤的影响。结果表明，低剂量芥子气染毒条件下，吲哚美辛组与两药合同组均可降低耳肿胀程度，抑制率分别为45.0%和19.1%。高剂量芥子气染毒条件下，MUS003、吲哚美辛及药物合用组均可降低耳肿胀程度，抑制率依次是21.8%、28.9%和32.4%。

2.奥伐尼与PRAP抑制剂合用对小鼠耳郭染毒模型的影响染毒前给予辣椒素受体激动剂奥伐尼（0.5mg/耳，涂抹）与PARP抑制剂MUS003（200mg/kg，ip），考察两者合用对芥子气染毒皮肤损伤的影响。结果表明，低剂量芥子气染毒条件下，奥伐尼组与药物合同组均可降低耳肿胀程度，抑制率分别为56.9%和72.2%，且两药抑制耳肿胀具有显著地交互作用。在高剂量芥子气染毒条件下，MUS003组与合用组均可降低耳肿胀程度，抑制率为6.5%和28.3%。 结论 1.非甾体抗炎药吲哚美辛对低（32mg/mL）、高（128mg/mL）染毒剂量所致皮肤损伤具有较好的保护作用。辣椒素受体激动剂奥伐尼对低剂量芥子气所致皮肤损伤保护作用明显，优于吲哚美辛； 2.非竞争性（变构型）p38抑制剂BIRB796对芥子气损伤的保护作用强于竞争性p38抑制剂SB203580，这可能与BIRB796同时抑制SM诱导的p38和JNK磷酸化，而SB203580抑制p38激酶同时代偿性地引起JNK激酶磷酸化程度升高有关； 和 3.首次发现程序性坏死抑制剂可保护芥子气诱导的表皮细胞死亡，提示这一坏死机制参与了芥子气诱导的细胞死亡； 4.基于抗炎药物的药物组合方案中，奥伐尼与PARP抑制剂MUS003合用对芥子气染毒小鼠皮肤损伤保护作用优于单用方案，可作为备选药物组合方案进行下一步研究。综上，本研究通过对基于炎症反应不同环节的多种类别的抗炎药物进行了抗芥子气损伤的药效评价，明确了各类药物对芥子气损伤的保护作用及其特点，并提出了基于抗炎药物的抗芥子气损伤组合用药方案，为基于炎性反应的抗芥子气新药研究提供了重要的理论依据和实验基础。
目的：观察黄芪甲苷和SB203580对镉致大鼠血睾屏障破坏及相关蛋白表达改变的保护效应，并初步探讨黄芪甲苷的保护机制。

方法：21只成年雄性SD大鼠随机分为7组：单纯镉组（0.1%氯化镉腹腔内注射，1mg/Kg·d），镉加黄芪甲苷组（镉剂量同上，同时注射黄芪甲苷，10mg/Kg·d），镉加SB203580组（镉剂量同上，同时注射SB203580，100μg/Kg·d），以上各组又分为连续处理五天和十天两个时间组，对照组腹腔内注射等量生理盐水。各实验和对照组动物均为3只。取睾丸做H-E染色、免疫组织化学染色、血睾屏障超微结构观察以及Western bloting检测p38MAPK磷酸化水平改变。 结果：H-E染色观察对照组支持细胞核染色较浅且不规则，镉组支持细胞内有空泡形成，镉加黄芪甲苷组与镉加SB203580组未见明显形态异常。免疫组织化学染色观察对照组波形蛋白阳性产物在支持细胞基室腔附近的胞质中表达，间隙连接蛋白43、闭锁小带-1蛋白、Claudin-11阳性产物在生精上皮靠近基底部表达。镉组波形蛋白、缝隙连接蛋白43、闭锁小带-1蛋白、Claudin-11阳性产物表达均显著降低（P＜0.05），镉加黄芪甲苷组与镉加SB203580组阳性产物表达虽低于对照组但明显高于镉组（P＜0.05）。超微结构观察对照组血睾屏障紧密连接形态完整，呈连续的电子密度较深致密线，镉组血睾屏障紧密连接及支持细胞均见不同程度破坏，镉加黄芪甲苷组与镉加SB203580组破坏程度较相应处理时间镉组为轻。Western bloting结果显示镉组P-p38MAPK水平明显增强（P＜0.05），镉加黄芪甲苷组与镉加SB203580组P-p38MAPK水平虽高于对照组，但较镉组明显减弱（P＜0.

05),实验组之间两两比较无显著差异。2.在实验2中,两实验组软骨细胞NO浓度较对照组均下降(A组4.39±1.08vs26.68±12.51P<0.05；B组3.91±2.23vs26.68±12.51P<0.05),实验组之间NO水平无明显差异；实验组NOS表达水平较对照组也均下降(A组7.67±3.09vs33.33±12.23P<0.05；B组4.88±1.59vs33.33±12.23P<0.05),实验组之间NOS水平无明显差异。实验组MMP-3水平较对照组显著升高(A组117.2±21.4vs98.3±3.7P<0.05；B组112.2±13.6vs98.3±3.7P
目的： 研究紫杉醇联合顺铂对人乳腺癌细胞MCF-7增殖抑制作用，探索药物作用过程中与MAPK通路、Bcl-2基因家族关系及相关机制。 方法： 采用CCK-8试剂盒检测不同浓度紫杉醇、顺铂单独或联合作用MCF-7细胞48h后对细胞50%增殖的抑制浓度（IC50），以及紫杉醇、顺铂分别联合ERK通路阻断剂（U0126）、JNK通路阻断剂（sp600125）对细胞增值的的抑制率；采用流式细胞仪检测紫杉醇、顺铂作用细胞48h后的细胞周期分布情况；应用Western SRT1720化学结构 blot分别检测紫杉醇、顺铂及两药联合作用MCF-7细胞48h后MAPK通路蛋白及Bcl-2、Bax蛋白表达。

结果: 紫杉醇（0.025~0.4μM）、顺铂(1~16μM)联合作用细胞时呈协同作用（CI
目的 采用大脑中动脉阻塞法制备局灶性脑缺血再灌注模型,观察七氟烷预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤是否具有保护作用,并探讨大脑皮质C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)在七氟烷预处理减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的意义。方法 雄性Sprague-Dawley大鼠108只,体重250-280g,随机分为3组：假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和七氟烷预处理组(Sevo-pc组)。每组大鼠36只,又随机分为再灌注12h、24h、72h3亚组,每亚组大鼠12只。大鼠麻醉后,分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉,经颈总动脉向颈内动脉插入线栓,稍遇阻力即停止插入,阻断大脑中动脉血流1h后恢复再灌注,制备局灶性脑缺血再灌注模型。Sevo-pc组大鼠于缺血前1h持续吸入2.7%七氟烷；S组分离并结扎右侧颈总动脉和颈外动脉,不置入线栓。再灌注12h、24h、72h时Longa神经功能缺陷评分完成后,各亚组随机取6只大鼠断头取脑,2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-tfiphenyhetrazolium

chloride, 获悉更多 TTC)染色测定脑梗死体积比。各亚组余6只大鼠行心脏灌注后断头取脑,冠状切取缺血脑组织,常规行脱水、透明、浸蜡及包埋。苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色观察缺血侧皮质组织形态学特征,免疫组织化学染色测定缺血侧皮质周围CHOP蛋白表达,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotin-dUTP nick end labeling, TUNEL)法计数凋亡神经细胞。结果 1.成功制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。 2.神经功能缺陷评分：S组大鼠未见神经功能缺损。与S组比较,I/R组和Sevo-pc组神经功能缺陷评分显著升高(P
目的：探讨体外培养条件下糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞（HRMC）色素上皮衍生因子（PEDF）与血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响及其可能的作用机制，进一步阐明糖尿病肾病发病机制。 方法：采用不同浓度AGE-BSA作用HRMC或同一浓度诱导不同时间，噻唑蓝比色试验（MTT法）检测MC增殖活力，半定量逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)法检测VEGF、PEDFmRNA水平。免疫印记(Western-bloting)检测VEGF、PEDF蛋白及磷酸化p38MAPK蛋白表达。 结果：(1)不同浓度AGE-BSA干预系膜细胞24h和200mg/L浓度的AGE-BSA干预系膜细胞不同时间后，在一定浓度和时间范围表现明显的促系膜细胞增殖作用，各组与空白对照组、同浓度的BSA组或同时间点的BSA组比较差异均有统计学意义(P0.05)。(2)AGE-BSA在一定浓度和时间范围上调HRMCVEGFmRNA及蛋白，下调PEDFmRNA及蛋白表达，各组较对照组相比具有统计学差异(P<0.05)及下调PEDF表达的作用(P
膀胱癌是一种临床常见的癌症,世界范围内,在男性常见癌症中排第四,因癌症死亡原因中排第九。引起癌症死亡的男性对女性的比率约为3：1。根据统计,2010年美国约70530例新增膀胱癌症病人和14680例癌症相关性死亡病例。尽管很多膀胱癌病例发生时没有明显的暴露在癌基因下,但癌基因有很多诱发因素。膀胱癌的发病与地理、环境、种族、性别、血吸虫感染、吸烟、职业暴露以及遗传易感性等因素有关。外界因素直接或者间接作用,可以诱发膀胱尿路上皮细胞DNA异常改变,从而引起细胞生长失控,最终激活膀胱癌发生的共同生物学通路。膀胱癌的发生发展是一个多步骤的过程。在肿瘤发生发展的每个阶段都有不同的分子遗传学改变,这些基因型异常改变的长期积累最终导致恶性表型的出现。膀胱癌的分子遗传学改变主要包括两类：一类改变与低分级的肿瘤相关。这类改变促进细胞增殖,但对细胞微环境、细胞分化及细胞死亡和凋亡的作用很小或没有作用。另一类改变则与高分级的肿瘤发生相关。这类改变导致细胞增殖失控,使细胞周期和细胞凋亡失调节,与细胞分化密切相关。由正常上皮细胞向肿瘤细胞的发展过程中涉及许多基因的改变,包括癌基因、抑癌基因、细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因和DNA损伤修复相关基因等。

更多 在肿瘤学前沿领域研究中,作为关键调控因子的蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(CIP2A)最近认为其与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关,因而引起人们的极大兴趣。CIP2A作为一种新发现的原癌基因,可以通过稳定C-Myc、促进细胞增殖和锚定独立生长、阻滞衰老和分化来促进体内恶性肿瘤的发生和发展。因而受到极大的关注。本论文对CIP2A是否可以作为膀胱癌的诊断标志物进行了初步的研究。在分子水平,我们从临床筛选了46例新鲜膀胱上皮组织标本,其中38例为膀胱尿路上皮癌,8例为正常膀胱移行上皮。在38例肿瘤组织样本中有29例(76.32%)检测到CIP2A mRNA的表达,而8例膀胱正常移行上皮未检测到CIP2A mRNA.在蛋白水平,我们从临床筛选出111例石蜡组织标本(其中99例为膀胱尿路上皮癌组织,12例为正常膀胱移行上皮)进行切片,利用免疫组织化学染色法检测了CIP2A在膀胱尿路上皮癌组织中的蛋白表达情况。在正常组织中未发现C工P2A的蛋白表达。而在99例膀胱尿路上皮癌组织中有63例(63.

05）；药物组的细胞基因表达量显著降低（P<0.05）；而拉伸+药物组细胞基因表达量显著降低（P<0.05）。Col-Ⅱ的基因表达量：经过高应力拉伸，细胞Col-Ⅱ基因表达量明显下降（P<0.05），而SB203580对Col-Ⅱ的基因表达无明显影响，拉伸+药物组Col-Ⅱ基因表达量显著降低（P<0.05）。各组收集的培养液中代谢物通过ELISA分析检测得出：与空白组相比较，高应力拉伸后释放入培养液的Col-X含量显著增高（P<0.05）；经过p38MAPK抑制剂SB203580处理后的细胞产生的Col-X含量明显下降（P<0.05）；而加入SB203580后经过高应力拉伸，与单纯拉伸相比，Col-X含量明显下降（P
绒毛膜癌是一种高度恶性滋养细胞肿瘤，起源于培养滋养层，可能发生于流产之后，或异位妊娠过程中。绒癌可通过静脉和淋巴系统广泛地转移到其他器官或组织中。早期血液和淋巴结转移可导致患者迅速死亡。近年来转化生长因子β(transforming

growth factor-β，TGFβ)成为肿瘤研究的热点因子之一，并且它在绒癌的发生和发展中是一个关键因素。转化生长因子β（TGFβ）是一种具有多生物学活性功能的多肽类细胞因子，TGFβ至少有5种异构体（TGF-β1～5），其中TGF-β1是主要存在形式，几乎所有的细胞都能分泌TGF-β1。它可以调节细胞增殖、分化、促进细胞外基质(ECM)形成，参与胚胎发育调节等，并且其与肿瘤的发生发展密切相关。TGFβ/Smads信号转导通路主要由细胞膜表面的TGFβ受体及其下游胞质内Smad蛋白家族组成。TGFβ首先识别并与细胞膜表面的受体结合，受体复合物再激活其下游的蛋白smad2、3，使其磷酸化。被激活的smad2、3与Smad4结合，形成复合物，然后进入细胞核与核内的各类转录因子结合，调控靶基因的转录。近年来p38丝裂素活化蛋白激酶（p38mitogen-activated

以及 一般 protein kinase,p38MAPK）在肿瘤的侵袭转移的研究中也成为热点之一，并且有报道显示TGFβ可激活p38MAPK通路，在胃癌和大鼠心肌成纤维细胞中两个通路有交互作用，但在绒毛膜癌中TGFβ与p38MAPK通路相互作用的关键位点及其机制尚不明确，因此本实验拟应用TGF-β1受体阻滞剂及p38MAPK抑制因子对被TGF-β1刺激活化的绒癌JEG-3细胞进行干预，对两条通路的下游蛋白进行检测以揭示两条信号通路在绒毛膜癌中交互作用的位点和作用机制。 目的： 探讨TGF-β1介导的Smad3与p38MAPK在绒癌JEG-3细胞中的串话作用。 方法： 1.人绒癌细胞系JEG-3生长在含10%的胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每2-3d换液一次。当细胞长至70-80%左右时用0.02%EDTA和0.25%胰酶消化液按1:3的比例进行传代。 2.JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于24孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分为空白对照组，2h TGF-β1刺激组，6h TGF-β1刺激组。培养终止前2h和6h分别给予不同组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。每组设置3个复孔，用免疫荧光染色法对P-Smad的表达及核转位情况进行检测。 3. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分别为：空白对照组，TGF-β1刺激组，p38抑制剂（SB203580）1μM组，p38抑制剂（SB203580）3μM组， TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制剂（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用免疫印迹法检测各组细胞中Smad3以及P-Smad3的蛋白表达水平。

4. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分组情况如上所述。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制因子（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用实时定量PCR法检测smad3的mRNA表达水平。 Selleck ERK inhibitor 结果： 1.在对照组中，P-Smad的表达成云雾状主要呈现在胞浆中，少量表达在细胞核。TGF-β1给予2h后，P-Smad3呈现胞浆胞核均表达。在TGF-β1给予6h后，P-Smad3主要表达在胞核，即TGF-β1给予6h，P-Smad3基本完成了由胞浆到胞核的核转位过程。 2．与空白对照组相比，TGF-β1刺激组的Smad3，P-Smad3蛋白表达增高(P<0.05)，而TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组中随TGF-β1受体阻滞剂浓度的升高，Smad3，P-Smad3的蛋白表达呈浓度依赖性降低(P<0.05)。与TGF-β1刺激组相比，p38抑制剂（SB203580）1μM组，p38抑制剂（SB203580）3μM组中随着抑制因子浓度的升高，Smad3，P-Smad3蛋白的表达亦呈浓度依赖性降低(P<0.

正常巨噬细胞的骨架蛋白均匀分布在胞核与胞浆,在胞膜周边有轻度的集中。在CRH孵育细胞1h后,F-actin骨架蛋白向细胞周边聚集,膜上出现单层丝状伪足。UCN刺激后F-actin改变与CRH刺激后相似,吞噬30min时骨架蛋白重塑更明显, 60min时骨架蛋白表达量却下降。这种动态变化现象与CRH与UCN刺激后巨噬细胞吞噬改变相一致。 3.CRH以10-8M浓度孵育巨噬细胞30min后Rac1磷酸化水平明显增加,60min后RhoA磷酸化水平达到峰值。UCN在10-10~10-7M浓度孵育细胞时均可显著增强RhoA、Rac1磷酸化水平。其中10-8M的UCN孵育细胞30min后Rac1磷酸化水平增加最明显,但是RhoA磷酸化水平呈现双峰状增加,持续时间更长。 4.Rho-ROCK的特异性抑制剂W56、选择性Rac1抑制剂Y27632预孵育细胞后,可明显抑制CRH、UCN对巨噬细胞的促吞噬作用。Y27632、W56预孵育后细胞周边丝状伪足量少,周边聚集不明显,丝状、板状伪足伸展变短,可阻碍F-actin重塑。

和 5.CRHR1的特异性拮抗剂Antalarmin、CRHR1/R2非特异性拮抗剂Astressin预处理后,CRH与UCN孵育细胞对荧光微球的吞噬率明显下降。在Antalarmin预孵育后, CRH所致的RhoA磷酸化可被完全抑制,而对由CRH所致的Rac1磷酸化抑制的程度与Astressin预孵育后的效应接近。Antalarmin预孵育后,对由UCN所致的RhoA磷酸化水平没有影响,Rac1磷酸化水平轻微降低,但是在Astressin预孵育后, UCN孵育所致的RhoA、Rac1磷酸化水平均明显降低。 6.CRH与UCN孵育静息状态下的大鼠腹腔巨噬细胞,PKA活性增强非常显著。PKA活性在CRH作用后15min达到高峰,而在UCN作用后的10min至60min呈逐渐增加趋势。PKC活性在CRH与UCN孵育细胞后增加比较迅速,在15min时到达高峰。MDL-12330A预孵育细胞阻断PKA后,CRH、UCN对细胞RhoA磷酸化的影响均显著下降。在应用CR预孵育细胞后CRH对RhoA磷酸化增强,对Rac1磷酸化水平没有明显影响。但是CR预孵育细胞后UCN对RhoA磷酸化影响下降约63%,对Rac1磷酸化影响显著下降。 7.CRH以10-8M的浓度刺激巨噬细胞后ERK1/2磷酸化增强,5min时最显著,持续到15min。UCN孵育巨噬细胞后ERK1/2磷酸化水平5-30min持续高水平。在PD98059预处理后可完全抑制CRH对RhoA的表达升高作用,预处理后UCN对RhoA磷酸化升高完全被逆转,对Rac1的表达影响的抑制率达47.7% 很少 结论 1.CRH与UCN可明显增强巨噬细胞的吞噬功能,UCN的促吞噬作用强于CRH。CRH对吞噬作用的影响具有浓度依赖性,其中在10-8M浓度时对细胞吞噬效应最强;UCN在10-10~10-7浓度时均能够明显增强巨噬细胞吞噬功能。 2.CRH与UCN可增强巨噬细胞骨架蛋白重塑,这与CRH与UCN增强吞噬作用相一致。表现为CRH与UCN孵育后的巨噬细胞F-actin骨架蛋白向细胞周边聚集,膜上出现粘附斑以及伪足增加,尤其UCN刺激后细胞出现板状伪足延伸。

3.Rho GTPases在CRH与UCN调节巨噬细胞天然吞噬免疫中起到重要作用。CRH与UCN可通过增强巨噬细胞Rho GTPases中的RhoA、Rac1磷酸化水平,以促进巨噬细胞骨架蛋白的重塑,从而增强巨噬细胞的吞噬功能。 4.CRH与UCN通过不同的信号转导机制,最后由Rho特异性的通路调节大鼠腹腔巨噬细胞骨架蛋白重塑。CRH通过与CRHR1结合,激活cAMP-PKA/ERK1/2信号通路,促进RhoA、Rac1磷酸化;UCN主要与CRHR2结合,通过PKC/ERK1/2信号通路促进RhoA、Rac1磷酸化。 5.CRH与UCN是结构相关肽,对巨噬细胞天然吞噬功能的作用相似,但是信号通路不同。这种差异性反映了它们在调节巨噬细胞吞噬过程中对吞噬活性以及细胞骨架蛋白重塑的影响有所不同。这些肽可能决定了微环境中由外源性刺激引发的细胞吞噬功能改变的程度。
随着人们对β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)介导的小胶质细胞免疫异常在阿尔茨海默病(Alzheimer’s 时间 Disease, AD)发病机制中所起的关键性作用的认识,通过抑制脑内胶质细胞过度免疫激活所引起的Aβ神经毒性的策略已日益受到重视。AD脑内异常聚集的Aβ过度激活了小胶质细胞非特异性的免疫炎症反应并介导神经损伤。小胶质细胞表面相关的“受体”、细胞内丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)、核因子-κB和细胞因子可能参与Aβ激活小胶质细胞的整个过程。同时,近年来人们对AD早期阶段的Aβ成分——可溶性Aβ寡聚体的研究也取得了重要的进展。研究Aβ寡聚体如何诱导小胶质细胞活化及其引发的神经毒性、明确其中的相应环节,对于探讨神经免疫炎症机制在AD发生、发展中的作用及寻找防治AD的药物靶标具有重要意义。 天然植物减毒单体——雷公藤氯内酯醇(tripchlorolide,

T4)具有很强的免疫抑制和抗炎活性。我们前期的研究发现,T4明显改善LPS诱导的小胶质条件培养基对皮层神经元的炎性损伤作用,并明显抑制LPS诱导的小胶质细胞产生炎症因子及细胞内氧自由基的产生。推测T4可能同样减轻寡聚态Aβ介导的胶质-炎症反应引起的神经毒性作用、并可能由此改善AD动物的认知能力。因此,本课题首先研究Aβ(1-42)对小胶质细胞活化、吞噬功能的影响及其机制；在此基础上观察T4对寡聚态Aβ(1-42)引发的胶质-炎症反应所产生的神经元毒性的影响,并探讨T4在Aβ介导小胶质细胞中MAPKs/NF-κB炎症信号通路的具体药理靶点和机制。最后选择快速老化小鼠P8(SAMP8)作为散发型AD的动物模型,从动物整体水平验证T4对SAMP8学习记忆功能的影响,并初步观察和评价药物的非临床安全性。结果总结如下： (一)Aβ(1-42)在AD炎症细胞模型中的作用及信号机制： 1.Aβ(1-42)能够诱导小胶质细胞形态发生分枝化或阿米巴样改变,但凝聚态和寡聚态Aβ(1-42)诱导小胶质细胞形态的表型有所不同。 2.寡聚态Aβ(1-42)激活小胶质细胞,能更早、更强烈地释放炎症介质(IL-1β、TNF-α、PGE2、NO)的产量、诱导细胞内氧自由基的产生,同时损害了小胶质细胞的吞噬功能。 3.凝聚态Aβ(1-42)维持了小胶质细胞缓慢、相对缓和且持续性的炎症反应。 4.寡聚态Aβ(1-42)损害了凝聚态Aβ(1-42)诱导的小胶质细胞的吞噬能力并与炎症介质水平的增高有关。早期抗炎和抗氧化治疗有助于改善AD炎症病理进程中小胶质细胞功能的损害。 5.寡聚态Aβ(1-42)可通过激活JNK、ERK和NF-κB信号通路诱导小胶质细胞炎症反应,但不通过p38MAPK起作用。 (二)T4在AD炎症细胞模型中的神经药理作用及其机制： 1.