正常巨噬细胞的骨架蛋白均匀分布在胞核与胞浆,在胞膜周边有轻度的集中。在CRH孵育细胞1h后,F-actin骨架蛋白向细胞周边聚集,膜上出现单层丝状伪足。UCN刺激后F-actin改变与CRH刺激后相似,吞噬30min时骨架蛋白重塑更明显, 60min时骨架蛋白表达量却下降。这种动态变化现象与CRH与UCN刺激后巨噬细胞吞噬改变相一致。 3.CRH以10-8M浓度孵育巨噬细胞30min后Rac1磷酸化水平明显增加,60min后RhoA磷酸化水平达到峰值。UCN在10-10~10-7M浓度孵育细胞时均可显著增强RhoA、Rac1磷酸化水平。其中10-8M的UCN孵育细胞30min后Rac1磷酸化水平增加最明显,但是RhoA磷酸化水平呈现双峰状增加,持续时间更长。 4.Rho-ROCK的特异性抑制剂W56、选择性Rac1抑制剂Y27632预孵育细胞后,可明显抑制CRH、UCN对巨噬细胞的促吞噬作用。Y27632、W56预孵育后细胞周边丝状伪足量少,周边聚集不明显,丝状、板状伪足伸展变短,可阻碍F-actin重塑。

和 5.CRHR1的特异性拮抗剂Antalarmin、CRHR1/R2非特异性拮抗剂Astressin预处理后,CRH与UCN孵育细胞对荧光微球的吞噬率明显下降。在Antalarmin预孵育后, CRH所致的RhoA磷酸化可被完全抑制,而对由CRH所致的Rac1磷酸化抑制的程度与Astressin预孵育后的效应接近。Antalarmin预孵育后,对由UCN所致的RhoA磷酸化水平没有影响,Rac1磷酸化水平轻微降低,但是在Astressin预孵育后, UCN孵育所致的RhoA、Rac1磷酸化水平均明显降低。 6.CRH与UCN孵育静息状态下的大鼠腹腔巨噬细胞,PKA活性增强非常显著。PKA活性在CRH作用后15min达到高峰,而在UCN作用后的10min至60min呈逐渐增加趋势。PKC活性在CRH与UCN孵育细胞后增加比较迅速,在15min时到达高峰。MDL-12330A预孵育细胞阻断PKA后,CRH、UCN对细胞RhoA磷酸化的影响均显著下降。在应用CR预孵育细胞后CRH对RhoA磷酸化增强,对Rac1磷酸化水平没有明显影响。但是CR预孵育细胞后UCN对RhoA磷酸化影响下降约63%,对Rac1磷酸化影响显著下降。 7.CRH以10-8M的浓度刺激巨噬细胞后ERK1/2磷酸化增强,5min时最显著,持续到15min。UCN孵育巨噬细胞后ERK1/2磷酸化水平5-30min持续高水平。在PD98059预处理后可完全抑制CRH对RhoA的表达升高作用,预处理后UCN对RhoA磷酸化升高完全被逆转,对Rac1的表达影响的抑制率达47.7% 很少 结论 1.CRH与UCN可明显增强巨噬细胞的吞噬功能,UCN的促吞噬作用强于CRH。CRH对吞噬作用的影响具有浓度依赖性,其中在10-8M浓度时对细胞吞噬效应最强;UCN在10-10~10-7浓度时均能够明显增强巨噬细胞吞噬功能。 2.CRH与UCN可增强巨噬细胞骨架蛋白重塑,这与CRH与UCN增强吞噬作用相一致。表现为CRH与UCN孵育后的巨噬细胞F-actin骨架蛋白向细胞周边聚集,膜上出现粘附斑以及伪足增加,尤其UCN刺激后细胞出现板状伪足延伸。

3.Rho GTPases在CRH与UCN调节巨噬细胞天然吞噬免疫中起到重要作用。CRH与UCN可通过增强巨噬细胞Rho GTPases中的RhoA、Rac1磷酸化水平,以促进巨噬细胞骨架蛋白的重塑,从而增强巨噬细胞的吞噬功能。 4.CRH与UCN通过不同的信号转导机制,最后由Rho特异性的通路调节大鼠腹腔巨噬细胞骨架蛋白重塑。CRH通过与CRHR1结合,激活cAMP-PKA/ERK1/2信号通路,促进RhoA、Rac1磷酸化;UCN主要与CRHR2结合,通过PKC/ERK1/2信号通路促进RhoA、Rac1磷酸化。 5.CRH与UCN是结构相关肽,对巨噬细胞天然吞噬功能的作用相似,但是信号通路不同。这种差异性反映了它们在调节巨噬细胞吞噬过程中对吞噬活性以及细胞骨架蛋白重塑的影响有所不同。这些肽可能决定了微环境中由外源性刺激引发的细胞吞噬功能改变的程度。
随着人们对β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)介导的小胶质细胞免疫异常在阿尔茨海默病(Alzheimer’s 时间 Disease, AD)发病机制中所起的关键性作用的认识,通过抑制脑内胶质细胞过度免疫激活所引起的Aβ神经毒性的策略已日益受到重视。AD脑内异常聚集的Aβ过度激活了小胶质细胞非特异性的免疫炎症反应并介导神经损伤。小胶质细胞表面相关的“受体”、细胞内丝裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)、核因子-κB和细胞因子可能参与Aβ激活小胶质细胞的整个过程。同时,近年来人们对AD早期阶段的Aβ成分——可溶性Aβ寡聚体的研究也取得了重要的进展。研究Aβ寡聚体如何诱导小胶质细胞活化及其引发的神经毒性、明确其中的相应环节,对于探讨神经免疫炎症机制在AD发生、发展中的作用及寻找防治AD的药物靶标具有重要意义。 天然植物减毒单体——雷公藤氯内酯醇(tripchlorolide,

T4)具有很强的免疫抑制和抗炎活性。我们前期的研究发现,T4明显改善LPS诱导的小胶质条件培养基对皮层神经元的炎性损伤作用,并明显抑制LPS诱导的小胶质细胞产生炎症因子及细胞内氧自由基的产生。推测T4可能同样减轻寡聚态Aβ介导的胶质-炎症反应引起的神经毒性作用、并可能由此改善AD动物的认知能力。因此,本课题首先研究Aβ(1-42)对小胶质细胞活化、吞噬功能的影响及其机制；在此基础上观察T4对寡聚态Aβ(1-42)引发的胶质-炎症反应所产生的神经元毒性的影响,并探讨T4在Aβ介导小胶质细胞中MAPKs/NF-κB炎症信号通路的具体药理靶点和机制。最后选择快速老化小鼠P8(SAMP8)作为散发型AD的动物模型,从动物整体水平验证T4对SAMP8学习记忆功能的影响,并初步观察和评价药物的非临床安全性。结果总结如下： (一)Aβ(1-42)在AD炎症细胞模型中的作用及信号机制： 1.Aβ(1-42)能够诱导小胶质细胞形态发生分枝化或阿米巴样改变,但凝聚态和寡聚态Aβ(1-42)诱导小胶质细胞形态的表型有所不同。 2.寡聚态Aβ(1-42)激活小胶质细胞,能更早、更强烈地释放炎症介质(IL-1β、TNF-α、PGE2、NO)的产量、诱导细胞内氧自由基的产生,同时损害了小胶质细胞的吞噬功能。 3.凝聚态Aβ(1-42)维持了小胶质细胞缓慢、相对缓和且持续性的炎症反应。 4.寡聚态Aβ(1-42)损害了凝聚态Aβ(1-42)诱导的小胶质细胞的吞噬能力并与炎症介质水平的增高有关。早期抗炎和抗氧化治疗有助于改善AD炎症病理进程中小胶质细胞功能的损害。 5.寡聚态Aβ(1-42)可通过激活JNK、ERK和NF-κB信号通路诱导小胶质细胞炎症反应,但不通过p38MAPK起作用。 (二)T4在AD炎症细胞模型中的神经药理作用及其机制： 1.