78%、104.08%、108.97%,亦即在formalin注射后5分钟出现了P-p38的表达峰值,随后恢复正常,但又在formalin注射后1天再次出现P-p38的表达增加之后恢复正常。 CX-4945体外 在此基础上,我们又分别观察了外周或鞘内给予第一组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂CPCCOEt或MPEP之后P-p38的表达情况。在formalin注射前15分钟分别在外周或鞘内给予CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者HEPES(100mM,pH7.4)作为对照,之后在formalin注射后5分钟和1天,取出动物腰膨大部位进行Western

blot检测。结果发现,在外周或鞘内给予CPCCOEt或MPEP之后,可以抑制formalin注射后5分钟时的P-p38的表达增加。而对于formalin注射后1天的P-p38增加,只有在外周给予CPCCOEt时表现出抑制作用。 本实验结果提示:1.formalin外周注射可以引起脊髓p38MAPK的活化,表现为磷酸化的p38MAPK表达增多,提示p38MAPK可能是介导formalin痛反应的主要信号通路;2.外周应用第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;3.脊髓应用第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制脊髓p38MAPK的磷酸化;4.以上结果提示提示第一组代谢型谷氨酸受体(包括外周和脊髓)通过活化脊髓p38MAPK信号通路在formalin引起的慢性痛中发挥重要作用。据我们掌握的文献,这是首次报道第一组代谢型谷氨酸受体通过脊髓(可能是小胶质细胞)p38MAPK在细胞水平介导其功能反应。 结论:1.formalin外周注射可以引起长时程痛敏(持续时间在10天以上),同时伴有脊髓小胶质细胞的活化;2.外周第一组代谢型谷氨酸受体的激活参与了长时程痛敏的发生和脊髓小胶质细胞的活化;3.脊髓第一组代谢型谷氨酸受体的激活参与了formalin诱导的长时程痛敏的发生和脊髓小胶质细胞的活化;4、外周和脊髓的第一组代谢型谷氨酸受体通过脊髓(可能是小胶质细胞)的p38MAPK通路介导上述作用;5、结合我们以往观察到的第一组代谢型谷氨酸受体在formalin急性痛反应中的作用结果提示,第一组代谢型谷氨酸受体(包括外周和脊髓)在痛信号产生和传递及由此引起的痛反应(包括急性痛反应和慢性持续性痛反应)中发挥重要作用。
β_2肾上腺素受体(β_2-AR)激动剂用于哮喘的对症治疗已有60多年的历史。SPFF[2-(4-amino-3-chloro-5-trifluomethyl-phenyl)-2-tert-butylamino-ethanol Crizotinib制造商 hydro-chloride]是沈阳药科大学制药工程学院合成开发的新型β_2肾上腺素受体激动剂,前期研究工作已证实它具有强大的支气管扩张作用和相对较高的β_2-AR选择性,同时还具有作用时间较长等特点,目前已处于Ⅱ期临床试验阶段。SPFF的结构中含有一个手性碳原子,因而存在一对对映异构体。由于具有不同立体构象的对映异构体在生物活性、毒性、药物代谢动力学等方面常有很大差异,因此,我们比较研究了SPFF的对映异构体((-)-SPFF和(+)-SPFF)的抗哮喘的作用特点,并初步探讨了它们的作用机制。

首先用离体实验考察了(±)-SPFF及其对映异构体对豚鼠气管平滑肌的扩张作用。结果显示,(±)-SPFF及其对映异构体都能够浓度依赖性的松弛静息张力和被气管致痉剂(组胺和乙酰胆碱)收缩的豚鼠气管条,(-)-SPFF的作用强度强于(±)-SPFF和(+)-SPFF。但是,单一对映体和(±)-SPFF松弛离体豚鼠气管平滑肌的最大效应彼此接近,表明三者的内在活性是相似的。同时我们通过对选择性β_2受体阻断剂ICI-118551拮抗(±)-SPFF、(-)-SPFF和(+)-SPFF作用的分析,还证实了SPFF的单一对映体扩张离体气管平滑肌的作用都是通过B_2受体介导的。离体豚鼠肺支气管灌流实验结果显示了(-)-SPFF在扩张整个气道作用中的显著优势,(-)-SPFF与(+)-SPFF的作用强度差别为23.2倍。此外,(+)-SPFF对(-)-SPFF的影响实验结果显示,(+)-SPFF与豚鼠气管条孵育20分钟对(-)-SPFF松弛静息张力气管条的量效曲线几乎没有影响。

selleck化学药品液面控制 其次,通过整体动物的不同模型,考察了(±)-SPFF及其对映异构体扩张在体气管平滑肌的作用。结果显示,灌胃给药时,(-)-SPFF(0.0625,0.25 and 1 mg·kg~(-1))对组胺和乙酰胆碱混合喷雾引起豚鼠窒息的保护作用与同剂量(±)-SPFF的作用相似:经十二指肠内给药时,(-)-SPFF对组胺诱导麻醉豚鼠肺溢流量增加的抑制作用分别强于(±)-SPFF和(+)-SPFF1.6倍和6.3倍:在肺机械功能实验中,单一对映体(-)-SPFF和(+)-SPFF与(±)-SPFF对肺顺应性的降低具有同等作用强度的抑制作用,(-)-SPFF抑制肺阻力升高作用强于(+)-SPFF约3.5倍。此外,SPFF、(-)-SPFF和(+)-SPFF(0.01、0.1和1μM)对致敏大鼠肺组织接触过敏原时释放组胺具有相似的抑制作用,在不影响小鼠气道粘液分泌的情况下,(-)-SPFF(0.04、0.10mg.kg~(-1))和(±)-SPFF(0.10、0.25 mg.kg~(-1))明显促进家鸽气道纤毛的转运功能,而(+)-SPFF(0.04、0.10和0.25 mg.kg~(-1))对家鸽气道纤毛的转运没有促进作用。静脉注射和口服(-)-SPFF对小鼠的LD_(50)(95%confidence limits)分别为55.7(51.6～59.8)和468.3(393.0～543.6)mg.kg~(-1),而静脉注射和口服(+)-SPFF对小鼠的LD_(50)分别为36.2(33.4～39.2)和297.5(257.5～343.7)mg.kg~(-1),提示(-)-SPFF的毒性低于(+)-SPFF。 此外,我们从激动剂在细胞外与受体的结合特征及在细胞内产生的效应([Ca~(2+)]_i)两方面初步探讨了(±)-SPFF及其对映异构体的作用机制。分别以豚鼠肺和心房组织作为β_2-AR和β_1-AR的来源,以碘标左旋吲哚洛尔((-)[~(125)Ⅰ]pindolol,IPIN)作为标记性配基的放射配基结合实验结果显示,(-)-SPFF对β_2-AR的亲和力分别高于(±)-SPFF 6倍和(+)-SPFF 164倍,这可能是(-)-SPFF扩张气道作用强度较高的原因之一。(-)-SPFF、(±)-SPFF和(+)-SPFF的选择指数(K_(i(atri))/K_(i(lung))分别为24.72、7.43和2.

01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组p-Smad3蛋白表达均显著降低(P<0.01)；氯沙坦组与QC小剂量组比较差异具有统计学意义(P<0.01)；各药物处理组α-SMA蛋白表达较TGF-β1刺激组均有不同程度下降,其中氯沙坦组下降最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)；QC小剂量组和氯沙坦组比较有显著差异(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Ⅰ型前胶原蛋白表达均显著下降(P<0.01)；氯沙坦组Ⅰ型前胶原白表达低于QC小剂量组(P0.05);与TGF-β1刺激组相比,各药物处理组Smad7蛋白表达均显著提高(P<0.01)；其中氯沙坦组升高最为显著(P<0.01),其次为QC大剂量组(P<0.01)；大、中剂量组增殖与TGF-β1刺激组相比,有非常显著性差异(P<0.01),其中以大剂量组减弱最为显著(P<0.01),其次为中剂量组(P0.05)。 2.各实验组细胞Smad2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ型前胶原mRNA表达的比较 (1) Smad2 mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞的Smad2 mRNA表达显著升高(P<0.01),其次为中剂量组(P0.05)。 (2)α-SMA mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组α-SMA

mRNA表达显著升高(P<0.05或P0.05)。 (3)Ⅰ型前胶原mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,大剂量组和中剂量组Ⅰ型前胶原mRNA表达均显著下降(P0.05)。 (4)Ⅲ型前胶原mRNA表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Ⅲ型前胶原mRNA表达表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组Ⅲ型前胶原mRNA表达均显著降低(P<0.05)；其中大剂量组下降最为显著(P<0.05),其次为中剂量组(P0.05)。 或者 3.各实验组细胞Smad2和(?)-Smad2蛋白表达的比较 3-Methyladenine数据表 (1) Smad2蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞Smad2蛋白表达明显升高(P<0.01)。与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组显著下降(P均0.05)。 (2) p-Smad2蛋白表达比较：与正常对照组相比,TGF-β1刺激组细胞p-Smad2蛋白表达显著升高(P<0.01)；与TGF-β1刺激组相比,大、中剂量组p-Smad2蛋白表达均显著下降(P<0.05或P0.05)。

结论 1.槲皮素能够显著抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的增殖。 2.槲皮素抑制了TGF-β1诱导的成纤维细胞Smad2、p-Smad、α-SMA、Ⅰ/Ⅲ型前胶原mRNA和蛋白的高表达。 3.槲皮素能够通过TGF-β1/Smad2信号通路改善TGF-β1诱导的成纤维细胞的生物活性的改变。
组织或器官纤维化是许多疾病致残、致死的主要原因,严重威胁着人们的健康与生命。目前针对纤维化病变的治疗手段极为有限,处于研究中的抗纤维化化合物很多,但进入临床的十分稀少。作用于多(?)点的吡非尼酮(PFD)的上市标志着抗纤维化药物的研究取得了很大挂展。因此,作用于多靶点纤维化药物的研究成为抗纤维化药物研究的重要发展方向。 吡非尼酮作用于纤维化过程不同环节中的多个靶点,是目前唯一以纤维化适应症上市的药物,课题组前期筛选到了吡非尼酮的ne-better药氟非尼酮(AKF-PD),已经完成临床前研究。由于强的首过作用,它们的作用强度均不够理想。鉴于该类化合物具有很好的临床应用前景,以此为基础的进一步研究具有重要意义。 购买Silmitasertib 本课题在前期研究的基础上,以保持吡非尼酮多靶点作用特点,(?)进代谢快的缺点为目标,设计了一系列新结构的化合物,以其获得(?)学和药动学方面性质优良的先导化合物,为开发新型抗纤维化药物提供候选化合物。并通过部分化合物的药效学研究,探讨高活性、多靶点作用的化合物结构特征,为抗纤维化药物的设计提供有价值的信息,为了解纤维化疾病的病理机制进行有益探索。 本课题以吡非尼酮为先导化合物,设计合成了苯基吡啶酮类化合(?)和苄基吡啶酮两个系列共52个吡啶酮类化合物。完成了目标化合物的结构确证,采用MTT法检测了目标化合物对NIH3T3细胞增殖的抑制活性。结果表明：设计的化合物活性均高于阳性对照药物氟非尼酮,选取4个化合物进行了大鼠体内活性测试和动物急性毒性实验,其中化合物3r与2j显示了很好的成药性

本课题初步归纳了设计合成的两系列吡啶酮类化合物抗纤维化活性的构效关系。结果表明：吡啶酮5-三氟甲基取代后活性明显升高；-苄基取代活性优于1-苯基取代；1位苯基取代基通过氨烷基链连接杂环后活性显著上升；苄基系列中杂环与苯环以氨丙基链连接为好,(?)位取代活性较高；而苯基系列苯环与杂环以氨乙基链连接为佳。在苯环上为非杂环取代的化合物中,侧链长短与活性关系不明显。 本课题在前期工作的基础上系统地合成了两个系列的吡啶酮类化合物,评价了目标化合物的抗纤维化活性,得到了2个成药性较好的化合物；本课题首次研究了吡啶酮类似物的抗纤维化活性构效关系,为进一步研究具有更高抗纤维化活性的新型多靶点化合物提供了重要信息和打下一了坚实基础。
寻找胚胎干细胞以及胚胎干细胞分化得到的细胞系的特异性标志物一直是干细胞研究领域的热点问题。由于干细胞保持自我更新和分化的信号通路尚未完全阐明,体内分化过程无法在体外培养模型中重现,专一的针对胚胎干细胞及其分化细胞系标志物的缺乏,影响了干细胞及其分化细胞系在临床中的应用。 本研究通过培养并定向诱导猕猴胚胎干细胞,利用检测胚胎干细胞关键基因OCT4,Nanog,SOX2的表达情况以及碱性磷酸酶(AKP)的检测来鉴定胚胎干细胞的培养状态;并用悬浮培养和RA+B27诱导的方法来定向诱导猕猴胚胎干细胞使其向神经干细胞方向分化。利用免疫荧光检测和RT-PCR检测神经干细胞关键基因Nestin, SOX2, Mushashi-1的表达来鉴定神经干细胞。并通过用差异酶处理法获得相对比较纯的神经干细胞。 利用噬菌体展示库PH.

用转录抑制剂放线菌素d预处理人血管内皮细胞,再以尿酸进行干预,应用real-timepcr在不同时间点检测enosmrna表达水平,以判断尿酸对rna稳定性的影响。3.用enos特异性抑制剂l-name预处理人血管内皮细胞,再用尿酸进行干预,mtt方法检测内皮细胞增殖情况,以判断尿酸对内皮细胞增殖的影响是否直接与enos有关。4.用westernblot方法分别检测不同时间点(10min,20min,30min,40min)经尿酸作用的人血管内皮细胞mapks(p38mapk,jnkmapk,erkmapk)通道是否有激活,判断不同血管内皮细胞是否被激活的mapks通道种类及激活时间不同。5.应用p38mapk通道特异性药物抑制剂(sb203580)预处理人冠状动脉血管内皮细胞,然后加入尿酸,通过real-timepcr的方法检测enosmrna表达水平变化,判断尿酸对enosmrna表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。应用腺病毒负性突变体p38-dn-adv转染人冠状动脉血管内皮细胞后再加入尿酸,通过westernblot方法检测enos蛋白表达水平的变化,判断尿酸对enos蛋白表达水平的调节是否通过p38mapk通道激活实现的。6.pgl2-enos(-331/+109)-fireflyluciferasereporter质粒和pgl2-β-actin-renillaluciferase共转染hcaec细胞后,加入600umol/l尿酸继续培养,双荧光报告基因系统检测尿酸是否影响enos启动子的活性,判断尿酸是否在转录前水平调节enos基因表达。7.用染色质免疫共沉淀技术检测转录因子gata-4与enos启动子的结合情况,以判断尿酸是否对该结合状况有影响。8.通过大鼠腹腔动脉血管环实验检测尿酸对动脉血管舒张功能的影响,并进行统计学分析。三、cyp11b2-344t>c基因多态性与高血压病心房颤动发生的相关性1.通过病例-对照研究进行meta分析,探讨cyp11b2-344t>c基因多态性和心房颤动易感性的关系。2.应用统计软件计算等位基因模型,纯合子模型,隐性模型和显性模型的优势比(or)和95%可信区间(ci),并通过固定效应和随机效应模型评估二者的关联性。3.根据异质性来源的不同进行亚组分析,最后达到应用单一原因对于总体结果进行评价,并对文章的发表偏倚进行评估。研究结果:1.研究发现高血压病患者血尿酸水平升高与心房颤动的发生密切相关(1)本研究共纳入940例患者,其中高血压病合并心房颤动患者362例,高血压病不合并心房颤动患者578例(对照组)。两组患者的性别、白细胞值、血钾值、肌酐值、收缩压、舒张压、左心室后壁厚度及室间隔厚度与心房颤动发生的风险均无统计学差异(p>0.05)。与对照组比较,高血压病合并心房颤动组平均年龄更大(67.13±10.59vs.56.78±14.92,p<0.01)、患高血压病平均时间更长(9.27±9.50vs.3.85±3.57,p<0.01),且血尿酸水平及左心房直径明显高于对照组,分别为388.11±112.51vs.311.54±122.51(p<0.01)及45.79±7.56vs.34.08±4.36(p0.05)和52.88%(p<0.01)。(8)染色质免疫共沉淀技术检测与对照组相比,尿酸使转录因子gata-4与hcaec细胞启动子的结合力增强。(9)在内皮依赖型缓激肽作用下,对照组大鼠离体腹腔主动脉血管环发生舒张。作为阴性对照组的l-name组动脉血管环舒张幅度明显减弱,和对照组相比,尿酸组动脉血管环的舒张幅度减弱48.53%(pc多态性明显与心房颤动易感性显著相关(等位基因模型:or=1.18,95%ci=1.04-1.33,pC基因多态性与心房颤动易感性存在显著的相关性。丰富了对心房颤动发病因素的认识,4.通过心房颤动病因方面的认识,可以从控制体内尿酸值的角度预防高血压病患者心房颤动的发生,为临床防治高血压病心房颤动的发生提供了新的思路。
在哺乳动物免疫系统中,白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)被认为是具有多重功能的重要细胞因子。IL-10由多种细胞分泌并作用于各种免疫细胞,如T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞和树突状细胞,调控这些细胞的生长、成熟、增殖、分化与活化,进而影响机体的天然免疫和获得性免疫,并与其它细胞因子一起维持了免疫系统的稳定。硬骨鱼IL-10在多种鱼类包括斑马鱼、金鱼、鲤鱼和虹鳟中被克隆鉴定,但有关硬骨鱼IL-10的免疫调节功能知之甚少,其受体和细胞信号传导途径,以及作用机制均有待阐明。本论文研究草鱼IL-10的免疫学功能,不仅揭示其保守的抑炎症功能,而且阐明它和另一经典抑炎症细胞因子TGF-β1参与免疫反应调节的相互关系和作用机制,从而拓展了对鱼类IL-10免疫学地位的认识。另外,为了解草鱼IL-10发挥作用的分子机制,进一步鉴定了草鱼IL-10介导的IL-10受体1(IL-10R1)和IL-10受体2(IL-10R2)及其下游信号通路(STAT3)和靶基因细胞因子信号转导负调控蛋白3(Suppressor

以及 Selleckchem MLN0128 {TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂|TNF alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂| buy TNF-alpha 抑制剂|TNF-alpha 抑制剂半抑制浓度|TNF-alpha 抑制剂价格|TNF-alpha 抑制剂花费|TNF-alpha 抑制剂溶解度|TNF-alpha 抑制剂购买|TNF-alpha 抑制剂制造商|TNF-alpha 抑制剂查找购买|TNF-alpha 抑制剂订单|TNF-alpha 抑制剂 mouse|TNF-alpha 抑制剂 chemical structure|TNF-alpha 抑制剂分子量|TNF-alpha 抑制剂 molecular weight|TNF-alpha 抑制剂数据表|TNF-alpha 抑制剂 supplier|TNF-alpha 抑制剂体外|TNF-alpha 抑制剂细胞系|TNF-alpha 抑制剂 concentration|TNF-alpha 抑制剂 nmr|TNF-alpha 抑制剂体内|TNF-alpha 抑制剂 clinical trial|TNF-alpha 抑制剂s|TNF-alpha signaling 抑制剂|TNF-alpha pathway 抑制剂|TNF-alpha 信号通路 抑制剂|TNF-alpha signaling 抑制剂s|TNF alpha pathway 抑制剂s|TNF-alpha 信号通路 抑制剂s|TNF-alpha 抑制剂 library|TNF-alpha activity inhibition|TNF-alpha activity|TNF-alpha inhibition|TNF-alpha 抑制剂s library|TNF alpha 抑制剂 libraries|TNF-alpha 抑制剂 screening library|TNF-alpha high throughput screening|TNF-alpha 抑制剂s high throughput screening|TNF-alpha phosphorylation|TNF-alpha screening|TNF-alpha assay|TNF-alpha animal study| of cytokine signaling 3,SOCS3)。为获悉草鱼IL-10的产生机制,初步探讨了LPS和IFN-γ对草鱼IL-10的转录调控机制。具体研究内容如下:1.

015),且与患者的性别、年龄、瘤体直径、吸烟史、高血压史、血脂异常无明显相关(P>0.05)。

结论：PI3K在腹主动脉瘤中高表达,可能在疾病的发生中发挥重要作用,其具体作用机制仍需进一步实验研究阐明。
慢性粒细胞白血病（Chronic Myeloid Leukemia，CML）是一种起源于白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs)的恶性增殖性疾病，迄今没有有效的根治办法。目前国内外的研究普遍认为LSC是正常造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSCs）经BCR-ABL癌基因转化而来。由于BCR-ABL基因编码的BCR-ABL融合蛋白具有持续活化的酪氨酸激酶活性，使得LSC具有比HSC更强的自我更新和增殖能力而大量扩增。LSCs也因此被认为是CML发病的根源，靶向BCR-ABL清除LSCs对于治愈CML具有重要的临床意义。格列卫（Imatinib 通常 Mesylate，IM）是以BCR-ABL蛋白为靶点治疗CML的分子靶向药物，能使绝大部分CML患者获得有效缓解，成为当前CML治疗的一线药物。然而，研究发现IM只能杀死增殖的成熟CML细胞而不能有效诱导LSCs凋亡。因此，IM不能彻底清除CML患者体内的LSCs而无法根治CML。LSCs对格列卫的凋亡抗性机制迄今不完全清楚。阐明LSCs的格列卫凋亡抗性机制对于以LSCs为靶点制定根治CML的策略具有重要意义。大量的研究表明，miR-21的异常表达与肿瘤细胞耐药密切相关miR-21抑制剂能有效增强化疗药物对肿瘤细胞的凋亡诱导作用。目前，miR-21在LSCs中的表达及其与LSCs的格列卫凋亡抗性的关系尚无研究报道，有待深入探讨。 Selleckchem Fasudil 本论文采用Real-time

PCR技术检测IM处理后CML CD34+干/祖细胞以及Sup-b15细胞和CML细胞K562、Ku812的miR-21的表达水平变化，在此基础上，进一步通过miR-21激动剂及其抑制剂转染、流式细胞术等方法，研究miR-21在调控CMLCD34+干/祖细胞对IM的凋亡抗性中的作用及其分子机制。 研究目的 本论文通过研究miR-21在调控CD34+干/祖细胞对IM的凋亡抗性中的作用及其分子调控机制，探索增强IM清除LSCs的策略，为以LSCs为靶点根治CML提供参考资料和科学依据。 研究方法 1.探讨miR-21在调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性中的作用 1.1使用Ficoll利用密度梯度离心法把健康人和CML病人的骨髓样本进行分离，分别获得健康人和CML病人的骨髓单个核细胞（BMMC）；利用免疫磁珠分选系统（MACS）对健康人和CML病人的骨髓单个核细胞分别进行分选，获得健康人和CML病人CD34+干/祖细胞；流式细胞术鉴定CD34+干/祖细胞的分子表型及其纯度。 1.2Annexin

V/PI双染法检测IM诱导的CML CD34+干/祖细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后CML CD34+细胞的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测转染antagomiR-21对IM诱导的CML 没有 CD34+细胞凋亡的影响。 1.3MTS方法检测IM对Sup-b15细胞增殖的影响；Annexin V/PI双染法检测IM诱导的Sup-b15细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后Sup-b15细胞的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测Sup-b15细胞转染antagomiR-21后，IM诱导的细胞凋亡变化。 1.4MTS方法检测IM对CML细胞K562和Ku812的细胞增殖影响；Annexin V/PI双染法检测IM诱导的CML细胞K562和Ku812的细胞凋亡；Real-time PCR检测IM处理后CML细胞K562和Ku812的miR-21表达水平；Annexin V/PI双染法检测K562和Ku812转染agomiR-21后，IM诱导的细胞凋亡变化。 2.探讨miR-21调控CML CD34+细胞对IM凋亡抗性的分子机制研究 2.1流式细胞术检测CML CD34+细胞和三种Ph+白血病细胞（K562、Ku812、Sup-b15）细胞经过IM处理后细胞内PTEN和PDCD4蛋白的表达水平变化；检测CD34+干/祖细胞转染antagomiR-21后PDCD4及磷酸化AKT蛋白的变化情况，评价抑制miR-21对PI3K/AKT信号通路的影响。 2.2Annexin V/PI双染法检测PI3K抑制剂（Wortmannin或LY294002）和IM联合作用于CML CD34+细胞和Sup-b15细胞后，CML CD34+细胞和Sup-b15细胞的细胞凋亡。 2.3流式细胞术检测PI3K抑制剂（Wortmannin或LY294002）和IM联合作用于CMLCD34+干/祖细胞和Sup-b15细胞后细胞内磷酸化AKT蛋白的变化情况。 实验结果 1.探讨miR-21在调控CML CD34+干/祖细胞对IM凋亡抗性中的作用 1.

三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导的HSC细胞中Smad4细胞内定位的影响 BVD-523购买 TGF-β1可诱导Smad4表达增加,并促进其入核；三种MAPK抑制因子均可抑制Smad4入核,但对其表达无显著影响。 3Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-p,诱导HSC细胞内Imp7/Imp8蛋白表达的影响 3.1Western blot去检测三种MAPK抑制因子对TGF-β,诱导HSC细胞内Imp7蛋白表达的影响 在无TGF-β1刺激条件下,Imp7蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp7表达及入核；三种MAPK抑制因子均可抑制Imp7表达及入核。

3.2Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导HSC细胞内Imp8蛋白表达的影响 在无TGF-β1刺激条件下,Imp8蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp8表达及入核；三种抑制因子均可抑制Imp8表达,p38抑制因子可减少Imp8入核。 4.三种MAPK抑制因子对TGF-p,诱导的HSC细胞内PAI-1mRNA表达的影响 TGF-β1可明显诱导PAI-1mRNA表达,ERK、JNK及p38抑制因子均能抑制TGF-p1诱导的PAI-1mmRNA表达。 5.三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导的HepG2细胞内MAPK通路活化的抑制作用 5.1ERK抑制因子(PD98059)对TGF-β1诱导的HepG2细胞内ERK通路活化的抑制作用 在无TGF-β1刺激时,HepG2细胞内的ERK通路已有一定程度磷酸化；TGF-β1则进一步增强pERK的表达。而ERK抑制因子(PD98059)可明显抑制pERK的表达。

5.2JNK抑制因子(SP600125)对TGF-β1,诱导的HepG2细胞内JNK通路活化的抑制作用 在无TGF-β1刺激时,HepG2细胞内的JNK通路已存在明显磷酸化；TGF-β1则进一步增强pJNK的表达。而JNK抑制因子(SP600125)可明显抑制pJNK的表达。5.3p38抑制因子(SB203580)对TGF-β,诱导的HepG2细胞内p38通路活化的抑制作用 在无TGF-β1刺激时,HepG2细胞内的JNK通路已存在明显磷酸化；TGF-β1则进一步增强pp38的表达。而p38抑制因子(SB203580)可明显抑制pp38的表达。 6.三种MAPK抑制因子对HepG2细胞内TGFβp1诱导的磷酸化Smad3C、Smad3L转位的影响 在无TGF-p1刺激条件下,Smad3C及Smad3L磷酸化程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Smad3C、Smad3L磷酸化,并促进pSmad3C、pSmad3L入核。ERK抑制因子、JNK抑制因子显著可抑制Smad3L磷酸化及其入核,p38抑制因子抑制Smad3L磷酸化,但对其核浆分布无明显影响。TGF-β1及三种MAPK抑制因子对Smad3C磷酸化均未见显著影响,但TGF-β1增加pSmad3C入核,三种MAPK抑制因子可抑制pSmad3C入核。7.三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导HepG2细胞内Smad2/3/4复合物形成的影响 CHIR-258浓度 在无TGF-β1刺激的对照组HepG2细胞中,无Smad2/3/4复合物形成,TGF-β1可显著诱导Smad2/3/4复合物形成；p38抑制因子(SB203580)几乎完全阻断Smad2/3/4复合物的形成；JNK抑制因子(SP600125)呈浓度依赖性抑制TGF-β1诱导的S1mad2/3/4复合物形成；ERK抑制因子(PD98059)对复合物形成没有明显影响。各组HepG2细胞内Smad2/3蛋白的表达量没有变化,同时细胞提取物中Smad4蛋白的表达量在各组间也没有差异。 8.Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导HepG2细胞内Imp7/Imp8蛋白表达的影响 8.1Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β,诱导HepG2细胞内Imp7蛋白表达的影响 在无TGF-β1刺激条件下,Imp7蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp7表达及入核；三种MAPK抑制因子均可抑制Imp7入核,尤其是p38抑制因子。

8.2Western blot法检测三种MAPK抑制因子对TGF-β1,诱导HepG2细胞内Imp8蛋白表达的影响 在无TGF-β1刺激条件下,Imp8蛋白表达程度很低且核内表达很弱。TGF-β1可诱导Imp8表达及入核。ERK抑制因子、JNK抑制因子可抑制Imp8入核,p38抑制因子对Imp8核浆分布无明显影响。 9.三种MAPK抑制因子对TGF-β1诱导的HepG2细胞内PAI-1mRNA表达的影响 KRX-0401制造商 TGF-β1可明显诱导PAI-1mRNA表达,ERK、JNK及p38抑制因子均能抑制TGF-β1诱导的PAI-1mRNA表达。 结论 5.1TGF-β1诱导HSC细胞及HepG2细胞中Smad3C及Smad3L磷酸化、进而促进Smad2/3/4复合物形成及其转位入核和靶基因PAI-1mmRNA表达可能是肝纤维化-肝癌发病的重要机制,而其中TGF-β1诱导的Smad3L的磷酸化可能是肝纤维化-肝癌发病的最关键环节。 5.2在HSC细胞中ERK、.INK、P38抑制因子均可明显抑制TGF-p1诱导pSmad3L的表达,JNK抑制因子可抑制pSmad3L入核；提示,Smad3蛋白连接区的磷酸化依赖于ERK、JNK、p38通路的激活,而pSmad3L转位入核则主要与JNK通路的激活有关。而在HepG2细胞中ERK抑制因子、JNK抑制因子显著可抑制Smad3L磷酸化及其转位入核,p38抑制因子抑制Smad3L磷酸化,但对其核浆分布无明显影响。三种MAPK抑制因子均可抑制pSmad3C转位入核。提示,在HepG2细胞中Smad3L磷酸化依赖于ERK、JNK、p38通路的激活,而pSmad3L转位入核则主要与ERK、JNK通路的激活有关。pSmad3C的转位入核则与ERK、JNK、p38通路的激活有关。 5.

5h即升高,3h达到高峰,6h后逐渐降低,损伤后3d降至正常水平；p38 MAPK的表达在损伤后1h开始升高,6h达到高峰,然后逐渐降低,损伤后5d降至正常水平；VCAM-1的表达在损伤后1h即升高,12h达到高峰,1d后逐渐降低,损伤后9d降至正常水平。结论：IL-1β、p38 HDAC 抑制剂 MAPK及VCAM-1在大鼠闭合性脑损伤早期即迅速升高,后期逐渐恢复正常,3者在损伤后表达的时序性变化特点基本一致,共同参与脑损伤的病理生理过程：3者作为联合指标,为推断闭合性脑损伤时间提供实验性依据。
目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人恶性胶质瘤U251细胞增殖、细胞周期与凋亡的作用,探讨其分子机制。 方法:采用MTT法检测DADS抑制恶性胶质瘤U251细胞增殖的IC50值;流式细胞术检测DADS对U251细胞周期分布及凋亡率的影响;Real Time PCR、Western blot和免疫细胞化学分别检测细胞周期与凋亡相关基因与蛋白的表达;光学显微镜观察凋亡形态学改变。 结果:DADS呈浓度依赖性抑制U251细胞增殖,15、30、45、60mg·L-1DADS对U251细胞增殖的抑制率分别为22.01%、38.82%、49.23%、55.27%,差异均有显著性意义(P<0.05)。免疫细胞化学结果显示,45mg·L~(-1)DADS处理48h后,Bcl-2表达较未处理细胞表达明显下调,平均光密度值从0.75±0.06下降至0.34±0.03(P<0.05);Bax表达增强,平均光密度值0.63±0.04高于对照组0.26±0.03(P<0.01);Bcl-2蛋白与β-actin平均灰度值比为0.47±0.05,与对照组(0.67±0.06)比,差异有统计学意义(P
分子伴侣是一类在进化上十分保守的蛋白,调节细胞的基因表达、DNA复制、信号传导、分化、凋亡等。Mortal

in,作为HSP70分子伴侣家族成员之一,具有多种功能包括应激反应、胞内运输、线粒体输入、调控细胞增殖和分化等。 Mortalin在多种肿瘤中高表达,与肿瘤的发生、发展有关,但其与卵巢癌的关系知之甚少。本实验以含183例卵巢癌组织的芯片为基础,经免疫组化检测Mortalin在卵巢癌中的表达情况。结果显示,Mortalin在卵巢癌中高表达,且其表达随着卵巢癌分期的增加而增加；Mortalin在浆液性卵巢癌中的表达明显高于其在粘液性卵巢癌中的表达。由于卵巢癌分化程度不一样,其对化疗药物的敏感性存在差异,分化程度越低,对化疗药物的敏感性越差；肿瘤分期越高,其细胞分化程度越低,对化疗药物的敏感性也越差；而且,浆液性卵巢癌相对于粘液性卵巢癌更易产生耐药性。基于以上基础,我们推测Mortalin的高表达和卵巢癌耐药间可能存在一定的关系,有待于进一步证实。

2MeOE2 实时定量PCR及免疫印迹检测顺铂敏感型卵巢癌细胞(A2780)和顺铂耐药型卵巢癌细胞(A2780/cis)中Mortalin的表达,结果表明A2780/cis细胞中Mortalin的mRNA和蛋白表达水平都明显高于A2780细胞。下调A2780/cis细胞中Mortalin表达能够增强细胞对顺铂的敏感性；克隆形成实验和侵袭实验进一步证实,下调A2780/cis细胞中Mortalin表达可以有效的降低细胞的增殖率及侵袭性；裸鼠试验说明,下调Mortalin在A2780/cis细胞的表达可以有效地抑制其在体内的生长。 抑癌基因p53,与Bax、Mortalin等形成复合体,促进肿瘤的发生、发展。在卵巢癌中,顺铂引起的细胞凋亡是p53依赖的,p53的异常会导致卵巢癌的耐药。免疫荧光结果显示,下调A2780/cis细胞中Mortalin的表达能够重新激活p53、增强p53的核转位,即Mortalin抑制了p53的活力及其核转位,参与了卵巢癌的耐药。 Selleck Proteasome 抑制剂 PI3K/AKT和MEK/ERK是两条主要的促存活通路,Akt和Erk1/2作为这两条通路中的效应分子,激活下游蛋白,发挥抗凋亡作用,促进肿瘤的发展、转移等。免疫印迹结果显示,下调A2780/cis细胞中Mortalin表达能够明显抑制Akt和Erk1/2的磷酸化；再加以顺铂处理时,Akt的磷酸化水平仍保持在极其低的水平,而Erk1/2的活力却被激活。下调Mortalin表达加以顺铂处理时,抑制了PI3K/AKT存活信号通路的同时增强了P38/MAPK凋亡信号通路。下调Mortalin表达的A2780/cis细胞的p38的活力明显强于A2780/cis细胞,增强了顺铂诱导的细胞凋亡。

综上所述,Mortalin的高表达参与卵巢癌的耐药,下调Mortalin表达可以有效的降低卵巢癌耐药细胞的增殖率、侵袭率,增加其对顺铂的敏感性,逆转卵巢癌的耐药性,这与下调Mortalin表达重新激活p53活性和增加p53核转位、降低Akt的磷酸化、增加Erk1/2和p38的磷酸化相关。鉴于以上研究基础,Mortalin可以作为治疗卵巢癌耐药的一个潜在靶点。
目的： 研究急性单核细胞白血病细胞系U-937分化前后MS4A7基因表达水平的变化情况。揭示其与白血病不同阶段的相关性。研究调控MS4A7基因表达的主要信号通路,揭示异常细胞信号转导引起白血病和MS4A7基因表达异常的相关性。构建含有MS4A7基因启动子的虫荧光素酶报告基因质粒,建立启动子区缺失片段的报告基因质粒,研究MS4A7基因启动子区的启动活性片段,以及调控MS4A7启动子区转录活性的转录因子。 方法： 1.50nmol/L佛波酯(PMA)刺激6孔板培养的U-937白血病细胞系,在诱导刺激的0、1、3、5d后收集总RNA,反转录为cDNA后实时荧光定量PCR检测细胞内MS4A7基因mRNA表达量的改变。 2.ERK抑制剂U0126、p38 MAPK抑制剂SB230580、JNK抑制剂SP600125分别预处理U-937细胞6h,第一组处理后加入PMA,第二组不加PMA,两组细胞均作用48h后收集总RNA,反转录为cDNA后实时荧光定量PCR测定两种处理后对MS4A7基因的mRNA表达水平的影响。 3.PCR扩增MS4A7基因启动子区片段(-1536bp-+164bp),通过双酶切反应将MS4A7基因启动子片段和虫荧光素酶载体pGL3-Basic定向连接,得到pGL3-MS4A7-Promoter1～5重组质粒。重组子序列经双酶切、测序鉴定得到确认。将pGL3-MS4A7-Promoter系列重组质粒转染入细胞白血病细胞系(HL-60、U-937)和非白血病细胞系(HeLa、KOV-3),通过检测细胞中虫荧光素酶的活性探究MS4A7启动子活性片段。 4.建立基于实时荧光定量PCR分析的染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)方法初步探讨转录因子ATF2和ELKl对MS4A7基因启动子的调控作用。 结果： 1.U-937在50nmol/L PMA刺激24h后MS4A7基因mRNA表达量升高(P<0.05),并随着刺激时间的延长和细胞的分化,表达进一步增强,3-5d表达量维持恒定(P0.

186，p=0.064)，与E-cadherin的表达呈负相关关系(r=－0.221, p=0.027)，与N-cadherin表达呈正相关关系(r=0.321, p=0.001)，与Vimentin表达呈正相关，但差异无统计学意义(r=0.113, p=0.265) AZD6244 结论：1. TGF-β1/Smad信号转导通路介导食管鳞状细胞癌细胞系Eca109发生EMT；2. TGF-β1、p-Smad2/3蛋白在食管鳞癌中高表达，且TGF-β1与E-cadherin表达呈负相关，与N-cadherin表达呈正相关，提示TGF-β1/Smad信号通路调控的EMT改变与食管鳞癌发生发展密切相关。
第一章人胚胎干细胞(hESCs)向胰腺内分泌前体细胞诱导分化的比较 目的：通过比较文献中已报道的效率较高的诱导方案,找到在本实验室条件下获得胰腺内分泌前体细胞的最佳诱导方案。 方法：体外诱导hESCs需要依次经历限定性内胚层、胰腺内分泌前体最终才会成为胰岛素阳性细胞,这是体内β细胞发育分化过程的重演。利用本实验室已经建立好的条件,将人胚胎干细胞诱导至限定性内胚层阶段。然后分三组分别用D’Amour、Hongkui Deng、Hosoya实验室报道的诱导方案将细胞往胰腺内分泌前体诱导。在诱导的第10天以及第13天收集样本,用免疫荧光、间标流式、real-time

PCR等检测手段比较三种诱导方案获得胰腺内分泌前体细胞的效率。 结果：仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天的过程中PDX1十细胞的比例出现明显的上调；D’Amour组呈现显著下降趋势；Hongkui Deng组呈现基本持平状态。仅Hosoya小分子方案组在第10天至第13天能持续检测到较多的NGN3+细胞；D’Amour组呈现下降趋势,且NGN3+细胞比例很低；Hongkui Deng组几乎检测不到NGN3+细胞。 结论：仅Hosoya小分子方案能更好的将限定性内胚层细胞诱导为胰腺内分泌前体细胞(PDX1+&NGN3+). 第二章人胚胎千细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性(Ins+)细胞诱导分化的研究 目的：比较基础培养基：D/F-12、高糖-DMEM;成熟因子方案与HOsoya的小分子方案获得胰岛素阳性细胞的效率。 方法：利用第一章所得到的优势方案(小分子诱导方案),将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段,即诱导的第10天。然后将细胞分为两大组,其中一组用成熟因子方案诱导,另一组继续用Hosoya实验室报道的小分子方案诱导；分别考察两种诱导方案下,基础培养基中不同葡萄糖浓度在诱导第18天获得Ins+细胞的差异。用免疫荧光、间标流式、real-time

以及 PCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。 结果：高糖-DMEM加成熟因子组在诱导的第18天获得Ins+细胞的效率最高,达27.43%±2.97%。D/F-12加成熟因子组、高糖-DMEM加小分子组和D/F-12加小分子组的Ins+细胞比例都不及21%。而追溯到诱导的第13天检测成熟因子和小分子组在表达胰腺内分泌前体阶段标记基因显示成熟因子组PDX1、NGN3、Beta2基因的mRNA的相对表达量是小分子组的数倍 结论：培养基中葡萄糖浓度对终末形成Ins+细胞效率在成熟因子组中高糖能促使p细胞增殖,低糖能使细胞内Ins含量增加；而在小分子组中无区别。在获得Ins+细胞效率上高糖-DMEM加成熟因子比小分子方案有优势,其原因可能并不是胰腺内分泌前体阶段,PDX1+&NGN3+细胞数量的多少,而与其PDX1和NGN3表达量有关。推测PDX1、NGN3的表达可能存在一个阈值是激活其下游基因启动所必须的。

获悉更多 第三章人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案的优化 目的：以高糖-DMEM加成熟因子诱导方案为基础优化人胚胎干细胞来源的胰腺内分泌前体细胞向胰岛素阳性细胞诱导方案 方法：利用第一章所得到的优势方案(小分子诱导方案),将hESCs诱导至胰腺内分泌前体起始阶段,即诱导的第10天。以第二章中高糖-DMEM加成熟因子诱导方案为基础进行分组,将成熟因子Betacellulin、Exendin-4、IGF-1进行自由组合,分为无因子组、单因子组、双因子组、三因子组。将细胞诱导至第18天,用免疫荧光、间标流式、real-time PCR等检测手段比较各方案获得Ins+细胞的效率。 结果：在诱导第18天获得Ins+细胞比例最高的三组分别为双因子组中的Exendin-4&IGF-1、单因子组中的Exendin-4及IGF-1,其值分别为：32.63%±8.50%、31.60%±2.16%、30.63%±1.37%。其中单因子组中Exendin-4在real-time PCR检测的各项胰岛终末细胞标记基因的mRNA相对表达量与其余组相比明显要高。免疫荧光也直观的反应出其优势 结论：在高糖-DMEM加成熟因子诱导方案基础上优化后,高糖-DMEM加单因子Exendin-4在D18可获得31.60%±2.