5 Hz、1 Hz和2 还有 Hz,加载时间均为24 h,以0 Hz,即无加载频率、持续加载10 %张应变的VSMCs为对照组。采用免疫细胞化学法检测VSMCs形态和排列的变化;RT-PCR和Western blotting检测表型标志分子α-肌动蛋白(α-actin)、肌球蛋白重链(SM1/2)、肌动蛋白相关蛋白SM22α和调宁蛋白(h1-calponin)的mRNA和蛋白水平的变化;抑制剂或RNA干扰阻断可能的信号调节分子的活性或表达,包括p38、细胞外信号调节激酶1/(2extracellular signal-regulated kinases, ERK1/2)、蛋白激酶B(PKB/Akt)和Rho-鸟苷酸解离抑制因子(Rho-guanine nucleotide dissociation inhibitor, Rho-GDI alpha),研究了不同频率张应变对VSMCs表型转化的影响及其调节机制。 结果显示:①不同频率张应变可以诱导VSMCs频率依赖的表型转化,1
Hz的张应变明显促进了VSMCs由合成表型向收缩表型转化;②张应变可以频率依赖地激活p38、ERK1/2和PI3K/Akt的活性,其中以频率为1 Hz的张应变作用最强;③p38在不同频率张应变调节的VSMCs转化过程参与信号转导作用,而ERK1/2和PI3K/Akt无作用;④张应变诱导成熟VSMCs的表型转化是张应变直接作用于细胞的结果,并非是细胞旁分泌的作用;⑤Rho-GDI alpha在1 Hz张应变诱导的VSMCs表型转化中起负调控作用。 上述结果表明,不同频率张应变可以诱导体外培养的合成表型的VSMCs转化为收缩表型,其中以1 Hz的机械牵张作用最强,这个过程与p38信号通路和Rho-GDI alpha调节因子密切相关。结果提示,在体情况下血管应有其最适频率,防止VSMCs由收缩表型向合成表型过度转化,以维持血管结构和功能的稳定。此外,在血管组织工程的种子细胞(如VSMCs)种植过程,可以通过对其施加一定的频率以调节VSMCs的表型转化,提高种植效果。
线粒体偶联因子6在糖尿病中的临床意义及其机制研究 研究背景 糖尿病患者心血管疾病的发病率和死亡率显著增加，多种心血管疾病的危险因素在糖尿病患者中集簇，以致疾病早期就存在严重的内皮细胞损伤，导致内皮细胞旁／自分泌功能发生病理性改变，各种异常分泌的生物活性物质相互作用，进一步加剧内皮功能不全。内皮依赖性舒张血管功能受损是内皮功能不全的核心环节，在糖尿病及其血管并发症中尤为突出。 时间 在内皮源性舒张血管物质中，前列环素(PGI_2)广泛存在于各组织器官中，具有潜在的重要心血管调控作用。糖尿病患者血浆PGI_2水平异常，可能是心血管疾病发生的重要因素之一。既往研究发现糖尿病及高血糖刺激可改变环氧化酶活性，致使PGI_2合成与释放减少，而应用PGI_2类似物防治糖尿病心血管并发症具有明确的疗效。但过去对糖尿病中PGI_2异常及其调控机制的认识不够深入，人们推测并一直在寻找机体内源性PGI_2抑制物质，期望以此为突破口深入揭示糖尿病及其心血管并发症的发病机制，以寻找新的治疗靶点。
偶联因子6(CF6)是新近发现的、唯一的PGI_2内源性阻滞剂。早期仅认为CF6是线粒体ATP合酶柄部的一个结构亚基，与能量转导有关。最近发现CF6也大量存在于内皮细胞的表面，在剪切力或肿瘤坏死因子等因素刺激下，释放进入血液循环。动物实验证实CF6通过阻滞磷脂酶A_2(PLA_2)等途径，抑制PGI_2合成；临床研究发现CF6在高血压病、急性心肌梗死等心血管疾病中显著升高，与vW因子等内皮损伤标志物水平显著相关。CF6以循环激素样方式产生收缩血管、升高血压及提高心率等作用。上述研究发现说明循环CF6水平增加与内皮细胞损伤有关，并可能与内皮源性PGI_2降低有潜在联系。糖尿病患者存在严重的内皮损伤及功能不全，是其心血管并发症发生的基础，其中CF6循环水平的变化，对PGI_2的影响及其与糖尿病相关临床危险因素的关系目前尚不清楚；同时CF6的分泌调节机制有待阐明。 研究目的 1．本工作拟在2型糖尿病(T2DM)患者中测定其血浆CF6和PGI_2水平，分析二者与糖尿病临床表现的关系，以探讨CF6在糖尿病中的病理生理意义。 确认细节 2．在离体培养的原代人脐静脉内皮细胞(HUMECs)中，进一步研究糖尿病相关危险因素对CF6的影响。观察高糖对CF6合成、分泌的作用以及高糖状态下蛋白激酶C(PKC)及促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路分子的活化及其对CF6分泌的可能影响，以期探讨影响临床糖尿病患者循环CF6水平的可能机制。
对象与方法 根据WHO制定的糖尿病诊断标准，自2005年4月至11月期间，收集连续入院就诊的T2DM患者，依照拟定的纳入标准和排除标准，共有70例患者符合要求，允许纳入本研究最终分析阶段。其中，男37例，女33例，平均年龄(59.7±11.4)岁，糖尿病病程(9.3±3.4)年。对照组共收集56例，男性30例，女性26例，平均年龄(56.2±12.0)岁，年龄、性别构成在两组间基本一致。所有受试者均签署知情同意书并得到伦理委员会批准。 患者入院次日清晨空腹抽静脉血测定CF6、PGI_2、血糖以及其他生化指标。每位患者仔细记录年龄、性别、吸烟情况、冠心病家族史、用药史、既往病史，并完善检查身高、体重、血压腰围、臀围等项目以及心电图、胸片、眼底检查等辅助检查。 基于血糖升高是糖尿病最重要的危险因素之一，临床研究发现T2DM患者血浆CF6水平升高并与空腹血糖水平显著正相关(r=0.535，P＜0.01)，为进一步探讨二者关系，我们在体外原代培养的HUMECs上，观察高糖刺激对CF6分泌的影响。在所有的实验中，以5×10~5密度种植细胞，生长至亚融合状态用于实验。干预处理前，先剥夺富含血清(10％FBS)的生长培养基，将HUVECs以2％FBS在37℃培养24h。待生长至融合态后，分别给5.6mmol／L(对照组)、10mmol／L、20mmol／L、30mmol／L(高糖组)D-葡萄糖孵育，并以5.6mmol／L葡萄糖加24.4mmol／L甘露醇作为渗透压影响的对照组。在细胞内信号转导途径研究中高糖孵育前2h给予各种阻滞剂，对照组除外。 采集标本后，成批测量样本加入抑肽酶，低温冰箱保存。用放射免疫(RIA)液相均相竞争反应法测定CF6和PGI_2，按试剂说明书配制各种试剂和操作；用葡萄糖氧化酶法测定血浆葡萄糖；其他指标采用常规实验室方法测定。用实时定量RT-PCR方法检测CF6 mRNA的表达，并用Western blot方法检测MAPKs通路蛋白水平。 临床和基础实验分组收集数据资料，整理分析。应用SPSS 11.5软件，计算组间统计学差异，并进行单变量及多变量相关和回归分析。P＜0.