研究内容第一部分高迁移率族蛋白B1对严重烧伤大鼠KCs分泌促炎性细胞因子的影响 实验使用健康成年雄性SD大鼠32只，体重200-250g，购自安徽医科大学动物中心。大鼠实验前进行一周环境适应。大鼠分为A组（烫伤组）及B组（假烫组），A组大鼠(16只)予戊巴比妥（30mg/kg）腹腔内注射麻醉，剃除背部毛发，大鼠背部置于98℃的热水中浸润12秒，获得总体表面积（TBSA）30%的Ⅲ°烫伤模型（经病理切片证实，以下称烧伤）。烧伤后立即给予每只大鼠腹腔注射乳酸林格氏液（30ml/kg）复苏；假烫组（16只）大鼠予同样的处理，但给予室温水水浴且不予液体复苏。各组大鼠于烧伤或假烫后24h行心脏取血处死。采用肝脏原位灌注、密度梯度离心和选择性粘附法分离KCs。分别经锥虫蓝染色和乳胶微粒吞噬实验判断和鉴定。KCs活性和纯度均大于95%以上。分离后的KCs以1×10~6每孔的密度接种于24孔板中。A、B两组大鼠KCs各分为4组，分别接受不同浓度HMGB1（0、50、100、200ng/mL）刺激48h。收集细胞培养的上清液，使用大鼠TNF-α和IL-1β酶联免疫吸附试剂盒（美国BioSource公司）检测，相关操作按照生产商提供的说明书实行。

ERK inhibitor 第二部分RAGE受体在高迁移率族蛋白B1诱导严重烧伤大鼠KCs分泌促炎性细胞因子中的作用 健康成年雄性清洁级SD大鼠32只，体质量200~250g，购自安徽医科大学实验动物中心。大鼠常温下饲养1周，20g/L戊巴比妥钠腹腔注射（30mg/kg）麻醉后，背部置于98°C水中12s，造成30%TBSA Ⅲ度烫伤（经病理切片证实，以下称烧伤），烧伤后立即给予乳酸林格液腹腔注射（30mL/kg）进行液体复苏。伤后24h行心脏取血处死大鼠，采用肝脏原位灌注、不连续密度梯度离心和选择性粘附法分离KCs。分别经锥虫蓝染色和乳胶微粒吞噬实验判断和鉴定。KCs活性和纯度均大于95%以上。（1）取部分细胞按随机数字表法分为2组，各组样本数为8：①PBS对照组，加入1mL BMS-354825核磁共振 PBS液培养；②HMGB1刺激组，加入1mL浓度为100ng/mL HMGB1刺激。培养48h后行RAGE检测。（2）另取部分细胞按随机数字表法分为4组，各组样本数为8：①对照组，加入1mL PBS液培养；②HMGB1组，加入1mL浓度为100ng/mL HMGB1培养；③HMGB1＋抗RAGE抗体组，经1mL浓度为20μg/mL抗大鼠RAGE单克隆抗体孵育2h后，加入1mL浓度为100ng/mL HMGB1刺激；④HMGB1＋重组大鼠RAGE/Fc嵌合体（rrRAGE/Fc）组，0.5mL浓度为100ng/mL HMGB1与0.5mL浓度为5μg/mLrrRAGE/Fc孵育2h后，作用于细胞。培养48h后行TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA表达检测。

第三部分Toll样受体在高迁移率族蛋白B1诱导严重烧伤大鼠KCs分泌促炎性细胞因子中的作用 健康成年雄性清洁级SD大鼠32只，体质量200~250g，购自安徽医科大学实验动物中心。大鼠常温下饲养1周，20g/L戊巴比妥钠腹腔注射（30mg/kg）麻醉后，背部置于98°C水中12s，造成30%TBSA Ⅲ度烫伤（经病理切片证实，以下称烧伤），烧伤后立即给予乳酸林格液腹腔注射（30mL/kg）进行液体复苏。伤后24h行心脏取血处死大鼠，采用肝脏原位灌注、不连续密度梯度离心和选择性粘附法分离KCs。分别经锥虫蓝染色和乳胶微粒吞噬实验判断和鉴定。KCs活性和纯度均大于95%以上。分离后的KCs以每孔1×106个的密度接种于24孔板中。大鼠的KCs分离后分为四组：⑴对照组，RPMI-1640培养液中培养48h；⑵HMGB1刺激组，100ng/ml HMGB1刺激48h；⑶HMGB1+抗TLR2抗体组，20μg/ml抗TLR2抗体（美国Invivgen公司）培养2h后加入100ng/ml HMGB1刺激48h；⑷HMGB1+抗TLR4组,20μg/ml抗TLR4抗体（美国Invivgen公司）培养2h后加入100ng/ml HMGB1刺激48h。ELISA法测定KCs上清液中的TNF-α和IL-1β含量。Northern blot法检测KCs中TNF-α和IL-1β

mRNA的表达，Westernblot法检测KCs中p38及JNK的表达，EMSA法检测KCs中NF–κB活性。 四．研究结果 第一部分 来源于对照组和烧伤组大鼠的KCs分别用不同浓度的HMGB1（50-200ng/ml）处理48小时。运用ELISA法检测上清液中的TNF-α和IL-1β蛋白含量。结果表明：在正常情况下，KCs仅产生极少基础量的TNF-α和IL-1β。HMGB1通过剂量依赖的方式刺激KCs分泌TNF-α和IL-1β。此外，在至少给予50ng/ml剂量的HMGB1刺激情况下，烧伤组大鼠KCs产生TNF-α和IL-1β显著多于对照组。这种差异在使用100ng/ml或者更高浓度HMGB1刺激的实验组中更为明显。 时间 第二部分 培养48h后，HMGB1刺激组KCs表面RAGE表达水平（1.036±0.101）明显高于PBS对照组(0.191±0.024，t=-23.158，P=0.000)。培养48h后，与对照组比较，HMGB1组、HMGB1+抗RAGE抗体组和HMGB1+rrRAGE/Fc组KCs培养上清液中TNF-α和IL-1β含量均显著增高（P值均小于0.01），后3组组间两两比较差异均无统计学意义（P值均大于0.05）。培养48h后，与对照组比较，HMGB1组、HMGB1+抗RAGE抗体组和HMGB1+rrRAGE/Fc组TNF-α、IL-1β mRNA表达水平均显著增高（P值均小于0.01），后3组组间两两比较差异均无统计学意义（P值均大于0.05）。 第三部分 使用抗TLR2抗体或抗TLR4抗体预培养KCs都显著减少了HMGB1诱导的TNF-α和IL-1β分泌（p<0.01）。抗TLR4抗体较之抗TLR2抗体对HMGB1诱导的TNF-α产生具有更强的抑制作用（73%对53%，p0.05）。同时，TLR2阻断较之TLR4阻断更显著的抑制HMGB1诱导的IL-1β产生（80%对50%，p0.05）。 同时，KCs RNA的Northern blot分析表明：使用HMGB1刺激48小时后的KCs TNF-α和IL-1β的mRNA水平显著增加。此外，经过抗TLR2和TLR4预培养的烧伤后大鼠KCs显著抑制了HMGB1诱导的TNF-α和IL-1β的mRNAs表达(p<0.