2%胎牛血清诱导后可以分化为星形胶质细胞(GFAP阳性)和神经元细胞(TUJ1阳性)。HS-3能诱导神经球在末铺P-L-L的培养板中粘附和迁移,迁移距离呈现浓度依赖性,在80μg/mL HS-3作用72h后,神经球的迁移距离为438μm。HS-3还能有效维持神经球在撤离生长因子后细胞的存活。在HS-3的刺激下，神经干细胞能分化为神经元和星形胶质细胞,浓度增加,分化为神经元的比例增大；且更有意义的是分化的神经元细胞能沿着神经球轴线向外迁移,而分化的星形胶质细胞滞留在神经球中,。PD98059和Noggin对HS-3介导的细胞迁移没有影响,而LY294002能有效抑制神经球的迁移(P
糖皮质激素是治疗炎症及自身免疫性疾病的常见药物。内源性及外源性合成的糖皮质激素均能有效抑制炎症反应,纠正炎症反应的失衡,避免过度或持续炎症所引起的组织损伤。正由于疗效显著,糖皮质激素数十年来一直应用于临床一线,广泛用于败血症性休克、哮喘、炎性肠病、类风湿性关节炎和多发性硬化症等炎症相关性疾病的治疗。然而,由于长期使用所带来的副作用及日益增加的耐药性,糖皮质激素的临床效能正面临前所未有的挑战。因而,深入研究和进一步阐明糖皮质激素的作用机理是一项重要的科学问题。
长期以来广为人们认可的糖皮质激素作用机制是基因组学说,即：通过与糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor, GR)结合形成复合物,转位进入细胞核后,与靶基因启动子区域糖皮质激素反应元件(Glucocorticoid 哪里 responsive element,GRE)结合或者与转录因子相互作用,从而直接或间接调控靶基因的转录。以往的研究主要聚焦在信号分子及炎症介质等蛋白编码基因上,而对于与基因表达异常关系密切的非编码序列如microRNAs 很少 (miRNAs)的作用则知之甚少。 近年来,miRNA已成为基因表达调控的“明星”分子。它们由细胞内核基因组转录为RNA,经过Drosha和Dicer酶剪切加工后,成为成熟的miRNA。成熟miRNA的种子序列可与靶基因mRNA的3’端非编码区互补结合,导致mRNA降解或者蛋白翻译抑制。越来越多的证据表明：miRNA是机体内各种生理及病理活动的关键调节因子,并参与固有免疫应答及适应性免疫应答。Toll样受体(Toll
like receptor, TLR)是固有免疫细胞重要的识别受体,可结合病原体的特定结构成分,从而激活免疫细胞。其中,TLR4信号通路的活化,诱导大量不同的miRNA,例如miR-146a,miR-147,let-7e,let-7i和miR-155表达上调等；而这些miRNA又可靶向抑制某些信号传导蛋白的表达,反馈调控TLR4信号通路的强度,从而促进或者抑制炎症应答。这些研究结果提示：miRNA在炎症应答中扮演着重要角色。那么,糖皮质激素是否调控miRNA的表达?miRNA是否参与糖皮质激素的抑炎作用?作用机制又如何?目前,均未见系统的研究报道。 有鉴于此,我们以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应模型为研究对象,利用基因芯片等技术系统分析了糖皮质激素地塞米松对miRNA表达谱的改变情况,并对糖皮质激素调控miRNA表达的机制、miRNA参与糖皮质激素抑炎的作用及分子机制展开研究,以期阐明糖皮质激素抗炎的非编码RNA机制,为后续的药物开发提供理论和实验基础。 第一部分糖皮质激素影响microRNAs在炎症反应中的表达 巨噬细胞是天然免疫系统的重要组成部分,在炎症反应中起十分关键的作用。巨噬细胞等炎症细胞渗出是炎症反应最主要的特征。渗出的巨噬细胞是一柄双刃剑,一方面,巨噬细胞被激活后,释放炎性介质,激活免疫系统,有效地杀伤病原体,构成炎症反应的防御环节；另一方面,巨噬细胞过度激活则释放过量炎性介质、蛋白水解酶及氧自由基等加重组织损伤并延长炎症过程。Raw264.7细胞是小鼠来源的单核巨噬细胞系,在受到LPS刺激时,可模拟机体炎症细胞的反应状态,已成为一种常见的炎症反应细胞模型被广泛应用于炎症领域的相关研究。
据此,我们首先以LPS刺激Raw264.7细胞建立炎症反应模型,加入糖皮质激素地塞米松24h后,用Realtime PCR检测细胞炎症介质表达水平的改变,并用ELISA检测细胞外炎症介质的释放情况,结果发现：地塞米松可在mRNA水平下调TNF-a、IL-6及iNOS的表达,抑制TNF-a、IL-6及NO的合成及释放,提示糖皮质激素可显著抑制LPS所介导的巨噬细胞炎症反应。 ABT-263 为了进一步研究糖皮质激素对miRNA表达谱系的影响,我们以上述炎症模型为基础,利用基因芯片技术,系统分析了糖皮质激素对miRNA表达的调控作用,结果发现：LPS可上调巨噬细胞内96个miRNA的表达,下调30个miRNA的表达；在加入地塞米松后,与LPS+DMSO组相比,可上调巨噬细胞内96个miRNA的表达量,而下调的miRNA数量则为137个。通过生物信息学分析,我们挑选了其中部分与炎症密切相关的miRNA及表达差异较大的miRNA进行Realtime PCR的验证,结果显示：糖皮质激素可显著下调miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301b的表达,而对let-7i及let-7e的表达无明显影响。 本部分实验结果表明,糖皮质激素除了调控编码蛋白基因表达外,对蛋白非编码的miRNA亦具有明显的调控作用。 第二部分糖皮质激素下调microRNA-155发挥抑炎作用 第一部分的结果表明糖皮质激素可以明显影响miRNA的表达谱系的变化,那么miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301等这些变化的microRNA在糖皮质激素抑制炎症反应中的作用如何?为此,我们首先采用电转染的方法分别转染miR-146a、miR-147、miR-26b、miR-148、miR-32b、miR-155及miR-301模拟物(mimics)以上调这些miRNAs在巨噬细胞内的表达；其后,再进行地塞米松处理及LPS刺激。结果发现：过表达miR-155可显著拮抗地塞米松对TNF-a、IL-6及NO等炎症介质的抑制作用,提示miR-155参与糖皮质激素抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应的作用。 为了进一步探讨这种下调的miR-155表达对LPS诱导巨噬细胞炎症反应的影响,我们利用miR-155抑制剂(inhibitor)干扰Raw264.