F组P2X4R在致炎后第4天表达增多,于第7天时达高峰,第10天和第14天逐渐下降。2.与NS组相比,M组P2X4阳性细胞表达增多。3.M组和FM组在鞘内第6次予以吗啡后形成吗啡耐受,FM组比M组更易形成吗啡耐受。 结论:P2X4R可能参与大鼠急性吗啡耐受和福尔马林炎性痛的形成。
【研究目的】高分子量激肽原(high
molecular weight kininogen, HK)是血浆激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system, KKS)的主要成分之一,当KKS活化时,HK被降解为活化型的高分子量激肽原(HKa)。众多资料表明,KKS活化参与多种生理与病理学过程,因此认识活化产物HKa的血管生物学功能具有十分重要的意义。内皮祖细胞(EPC)是成熟内皮细胞(EC)的前身,在促进内皮再生和新生血管中发挥重要作用。虽然有研究表明,HKa抑制EC功能,但是HKa是否调控EPC功能不清楚。在这项研究中,我们检测了HKa是否诱导EPCs的衰老,并对其作用的分子机制进行了探索。 【研究方法】(1)我们从人外周血分离EPC,并建立可体外培养的细胞株。(2)为判定HKa是否影响EPC的功能,50nM HKa处理EPCs,检测其对EPC克隆形成及增殖能力的影响。(3)为检测HKa是否加速EPCs衰老,30-100nM HKa处理EPCs,检测酸性β-半乳糖苷酶活性和端粒酶活性情况。(4)为研究HKa加速EPCs衰老的机制,我们分别使用10、30、50、100nM Ion Channel Ligand Library nmr HKa处理EPCs,检测胞内ROS产生、JNK在Thr183/Tyr185位点和转录因子FOXO4在Thr451位点的磷酸化及p38激酶的磷酸化、锰超氧化物歧化酶和p16的表达情况。(5)为确定HKa的功能域,我们构建了人源HK重链(HC,19-380aa)和轻链(LC,390-644aa)重组蛋白,分析HKa作用的结构域。
【研究结果】(1)HKa抑制EPCs克隆形成及增殖能力。(2)HKa处理后的EPC变得大且扁平并出现空泡。使用酸性β-半乳糖苷酶染色法检测,显示HKa导致衰老细胞的百分比增加了2-3倍(P
神经干细胞(neural stem cells, NSCs)通过不断分裂增殖以维持自身稳定,并可分化成神经系统中所有种类的神经细胞,此外还具有高效迁移特性。在胚胎期的神经系统发育过程中,NSCs自脑室侧壁(lateral ventricle, LV)不断迁移至特定区域形成具有特定功能组织,进而构建出复杂的中枢神经系统(central 查找更多 nerve system,CNS),而NSCs的迁移缺陷则会导致许多神经退行性疾病;存在于成年大脑侧脑室外侧壁(subventricular zone, SVZ)和海马齿状回(dentate gyrus, DG)区域中的NSCs可定向迁移至分子颗粒层和嗅球(olfactory bulb, OB)等神经发生部位,参与神经组织的形成;最近有研究报道,NSCs还可朝向病灶位点做趋化性迁移,NSCs的这一特性给治疗神经损伤性疾病带来希望。因此,针对NSCs定向迁移机制的研究十分有必要。 有研究报道,大脑损伤区域以及病灶位点分泌多种细胞生长因子、趋化因子以及炎症因子。基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor, SDF-1α)是研究最为广泛的趋化因子之一,它通过与其专一性受体CXCR4结合,激活下游一系列信号通路。其中,PI3K/Akt和MAPKs信号通路参与调节SDF-1α诱导的NSCs的定向迁移。NSCs的迁移受到多种因素的综合调节,除了细胞外因子对其有促进或抑制作用,在特定环境中,还受到细胞自身状态的影响。有研究发现,具有初步分化特征的神经祖细胞(neural progenitor
cells, NPCs)展现出趋化性迁移能力,如:DCX或PSA-NCAM阳性的神经元前体细胞和表达A2B5的少突胶质细胞前体细胞,而未分化的NSCs(高表达干细胞标记物nestin)迁移能力相对低下,大部分停留在初始点。我们猜测处于特定分化阶段的NSCs具有更强趋化性迁移能力。为了验证这一假设,我们选用了来源于小鼠小脑皮层的神经干细胞系C17.2,对其进行分化诱导得到不同分化状态的NSCs并进行表型鉴定;利用Boyden chamber和Dunn chamber趋化性迁移装置检测不同分化状态的NSCs对SDF-1α的趋化性应答差异;通过探测肌动蛋白微丝F-actin的组装与聚合,对不同分化状态的NSCs中细胞骨架的重组频率和微丝的排列分布进行比较;为了进一步探索NSCs迁移与细胞分化状态之间的关系,我们随后在分子水平上研究与迁移分化相关联的内在机制。运用Western 也许 blot技术对细胞内涉及迁移的信号通路如PI3K/Akt和MAPKs蛋白家族信号通路(ERK1/2、SAPK/JNK、p38MAPK信号通路)的激活水平进行检测,分析了在不同分化状态NSCs中这些信号通路对SDF-1α刺激的应答差异;最后,利用特异性抑制剂将上述信号通路分别阻断,通过趋化性迁移实验检测了不同分化状态NSCs的迁移变化。综合上述实验,我们主要得到了以下结果: 1. NSCs向SDF-1α的趋化性迁移能力受分化状态的影响:在Boyden chamber趋化迁移实验中,不同分化状态的NSCs在5ng/ml SDF-1α的诱导下,迁移至下室的细胞数目不同,分化0.5天和1天的NSCs对SDF-1α应答能力最强;同时,分化0天、0.5天和1天的NSCs出现最大迁移数目的SDF-1α浓度为5ng/ml,而分化3天NSCs对应的最佳迁移浓度为50ng/ml,说明不同分化状态的NSCs对SDF-1α敏感程度不同。 2.特定分化阶段的NSCs拥有较强细胞趋化性迁移能力。细胞的迁移速度和迁移效率是构成迁移的基础要素,两者相互独立,受到不同信号通路的调控。在NSCs的不同分化状态下,NSCs具有不同的运动活性。分化0.5天和1天的NSCs随机迁移速度比其他分化状态的NSCs快。同时它们对SDF-1α的响应能力也因分化状态的不同而发生改变;在25ng/ml SDF-1α浓度梯度中,分化1天的NSCs迁移方向性效率最高,并且具有最大迁移速度。 3.