CCK-8实验用来检测BIIB021对Eca109和Eca9706细胞系的生长抑制情况处于对数生长期的食管鳞癌细胞Eca109和Eca9706,计数并分别接种于96孔板中,加入BIIB021(浓度梯度为：OnM,65nM,125nM,250nM,500nM, 1μM,2μM)培养5天。用CCK-8试剂盒检测在此浓度梯度下,BIIB021对Eca109和Eca9706的生长抑制情况。细胞活力=(实验组的OD450-空白组OD450)／(对照组OD450-空白组OD450)×100。2.通过克隆形式试验检测BIIB021联合放疗对Eca109和Eca9706克隆形成能力的影响一定数目的Eca109和Eca9706接种在六孔板中,加入IC25浓度的BIIB021(Eca109:

获悉更多 97nM; Eca9706:33nM)培养16h后,分别接受2Gy,4Gy,6Gy,8Gy的单次剂量照射,4h后更换培养基。接种后的14天计数克隆形成(大于50个细胞数为一个克隆)。3.流式细胞术检测细胞的凋亡和周期(实验分为：对照组,单纯照射组,单纯药物组,药物联合照射组)单纯照射组照射剂量为6Gy,单纯药物组药物浓度为1μM,药物联合照射组用1μM BⅡO021培养16h后接受6Gy的单次剂量照射,均在处理24h后收集细胞,分别用凋亡和周期试剂盒检测Eca109和Eca9706的凋亡情况和周期分布。4.Western blotting用来检测放射抵抗相关蛋白pEGFR, pAkt, Raf-1和凋亡相关蛋白cleaved PARP的表达情况以及pEGFR和pAkt的表达情况随BIIB021培养时间长短(12h,24h,48h)的变化结果：1.BIIB021以剂量依赖的方式抑制食管鳞癌细胞Eca109和Eca9706的生长,并且Eca9706对BIIB021更敏感。2.BIIB021减弱了放射后食管鳞癌细胞Eca109和Eca9706的克隆形成能力,提高了放射敏感性。3.BIIB021联合照射组与单纯BIIB021处理组及单纯照射组相比,显著增加了食管鳞癌细胞的凋亡,增强了细胞G2期阻滞,处在G2期细胞对放射更加敏感。4. BIIB021联合照射组与单纯BIIB021处理组及单纯照射组相比显著下调了放射抵抗相关蛋白pEGFR,pAkt,Raf-1的表达,同时BIIB021联合照射组凋亡相关蛋白cleaved Docetaxel制造商 PARP的表达显著升高。pEGFR和pAkt的表达随BIIB021培养时间增加而下调。结论：1.通过上述途径,BIIB021增强了食管鳞癌细胞对放射治疗的敏感性。所有的实验结果表明,BIIB021不论是作为单独制剂还是联合放疗都在食管鳞癌细胞中发挥了强大的抗肿瘤能力。2.放射治疗是针对晚期不能手术切除的食管鳞癌患者的主要治疗手段,并且术前或术后放疗在提高食管鳞癌患者的局部控制和生存率中起到非常重要的作用,但是内在的肿瘤抗辐射大大降低了放射治疗的敏感性。本实验结果证明,新型可口服的HSP90抑制剂BIIB021,可以同时阻断多种与食管鳞癌发生发展相关的信号通路,无论是作为单药制剂还是放射增敏剂,都为食管鳞癌患者提供了更好的治疗策略。
目的:1.表达并纯化较高活性的TRAIL蛋白,优化表达条件。2.观察TRAIL对大肠癌细胞HCT116、SW480和SW620细胞增殖的影响,并对机制进行初步分析。方法:1.TRAIL的表达与纯化。扩大培养含p

ET-d-TRAIL质粒的大肠杆菌DH5a,IPTG诱导表达TRAIL蛋白。表达产物经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化。利用MTT法测定纯化产物对大肠癌细胞SW480增殖的影响。分别改变诱导剂IPTG的浓度和诱导时间,从而确定诱导TRAIL的最适条件。在亲和层析过程中采用两种洗脱TRAIL的方式,并改变透析的时间,对比以上条件对TRAIL活性的影响。2.初步分析TRAIL对HCT116、SW480和SW620的增殖的影响。在HCT116、SW480和SW620三种大肠癌细胞中分别加入0、100、200和400mg/ml的TRAIL,培养12 CI-1040制造商 h后,光镜下观察TRAIL对细胞形态的影响;MTT法测定TRAIL对细胞增殖的影响;用western blot检测三种细胞中DR5、caspase-3、caspase-6、caspase-7、caspase-8和XIAP的蛋白表达水平;转染caspase-8质粒至SW620细胞,进一步观察高表达caspase-8的SW620细胞对TRAIL敏感性。结果:1.确定最适诱导条件:TRAIL工程菌在培养4 h后进入对数生长期,在IPTG浓度为0.5 mmol/L条件下37℃诱导6 h,TRAIL的蛋白表达量占总蛋白的比例达到20%。2.纯化出纯度高于95%的可溶性TRAIL蛋白。3.在细胞生长处于对数生长期时分别加入0、100、200和400mg/ml的TRAIL并培养12 h。MTT实验显示HCT116的细胞活力分别为对照组的65%、28%、6%。SW480细胞的活力分别为对照组的85%、65%、42%。SW620的细胞活力分别为对照组的95%、94%、91%。4.