05)。 2.5 Celecoxib对MDA-MB-231细胞p65与DNA结合能力的影响 EMSA结果显示,在探针冷竞争反应中,正常的标记探针和NF-κB的结合条带会被100倍过量的未标记探针抑制;而在突变探针冷竞争反应中,正常的标记探针和NF-κB结合的条带不会被100倍过量的未标记突变探针抑制。结果提示,MDA-MB-231细胞中NF-κB处于组成性活化状态。 此外,与对照组相比,80μM的celecoxib作用24h后,MDA-MB-231细胞的DNA-蛋白质复合物区带明显变浅,提示celecoxib可以降低MDA-MB-231细胞中NF-κB

DNA的结合活性。 2.6 Celecoxib抑制MDA-MB-231细胞中凋亡相关分子Bcl-2的蛋白表达 Western blot分析结果显示,80μM的celecoxib能够明显抑制MDA-MB-231细胞中NF-κB下游Bcl-2分子的表达(P0.05)。 3.5过表达p65基因对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 FCM检测结果发现,转染p65cDNA的MDA-MB-231细胞给予80μMcelecoxib共孵育48h后,细胞的凋亡率为18.53±2.51%,而空载体对照组细胞为31.21±3.29%,两者比较差异具有统计学意义(P0.05)。 3.6过表达p65基因对MDA-MB-231细胞侵袭性的影响 Transwell侵袭小室检测结果显示,转染p65cDNA的MDA-MB-231细胞培养6h后,基本没有细胞侵袭过matrigel胶,而在12h,实验组和对照组侵袭的细胞数无明显差异(P>0.05)。24h后可见转染p65cDNA的细胞克隆侵袭细胞数明显多于对照组,差异具有统计学意义(P
近年来2型糖尿病的发病呈快速增长趋势,目前估算到2030年全球糖尿病患病人数将超过3.5亿。由糖尿病引起的死亡人数仅次于心脑血管疾病、恶性肿瘤,被称为“第三杀手”,我国现有糖尿病人数目前居世界第二位。流行病学资料表明,随年龄增加2型糖尿病患病率也明显增加,是影响中老年人健康的主要疾病之一。与糖尿病相关的慢性并发症如心脑血管疾病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变以及糖尿病神经病变是致死、致残的主要原因,严重威胁人类健康。胰岛素抵抗(insulin Silmitasertib分子重量 resistanse, IR)是肥胖和2型糖尿病早期和重要的发病机制,其定义为由于肝脏、脂肪和肌肉等靶组织对胰岛素生物效应的反应性降低。导致胰岛素抵抗的具体机制尚不十分清楚。骨骼肌是机体葡萄糖、脂质摄取和利用的器官,是胰岛素发挥作用的重要组织。 Danusertib小白鼠 遗传因素和环境因素均可诱导IR的发生,动物和人的实验均表明无论是通过脂质灌注,还是慢性的高脂饮食,血中游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)升高均可导致胰岛素抵抗,而且不同类型脂肪酸作用不同,而饱和脂肪酸尤为重要,高脂是诱发IR的独立危险因素之一。长期高脂饮食或短期脂肪酸输入导致人或动物骨骼肌线粒体相关蛋白表达变化和功能异常。老年人、2型糖尿病患者、2型糖尿病一级亲属的骨骼肌线粒体代谢能力下降,而且胰岛素抵抗个体线粒体代谢的标志物的表达已经发生改变、出现线粒体功能下降,导致肥胖和脂质堆积,所以线粒体代谢的标志物在胰岛素抵抗和2型糖尿病发病机制中扮演重要作用。由此可见,骨骼肌线粒体功能紊乱可能是导致IR的一个重要原因,但具体机制尚不清楚。老年人易发生的IR可能与肌肉细胞内的线粒体作用减退或缺陷有关。

过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator

1α,PGC-1α),是一种核转录共激活因子,可调节线粒体生物发生、糖代谢、脂肪酸氧化、胰岛素分泌等诸多生物过程。线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2),不仅促进线粒体的融合,维持线粒体结构完整性,而且还参与线粒体的代谢调节。核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)是一种由核基因组编码的,对线粒体基因组表达的复制转录和翻译过程中重要的酶及蛋白因子起调控作用,对维持线粒体结构与功能发挥重要作用。PGC-1α作为转录共激活因子可以调节Mfn2的表达和NRF-1的转录。因此,骨骼肌线粒体相关因子PGC-1α、Mfn2和NRF-1的表达异常可能导致骨骼肌线粒体形态和功能的改变,其中PGC-1α在线粒体功能和胰岛素抵抗中的作用成为近年来研究的热点。 研究发现高脂引起骨骼肌线粒体相关蛋白PGC-1α,Mfn2、NRF-1表达下降,同时伴有胰岛素信号通路相关蛋白的表达异常及胰岛素抵抗,说明骨骼肌线粒体功能和胰岛素抵抗关系密切,而且PGC-1α可能在调控线粒体功能和胰岛素抵抗方面发挥重要作用。目前假说认为血中FFA升高或上述各种原因导致的线粒体功能异常均影响了脂肪酸进入线粒体的氧化过程,从而导致长链乙酰辅酶A(long-chain Ipatasertib 花费 fatty acyl coenzyme A ,LCACoA)的堆积,甘油二酯(diacylglycerol ,DAG)生成增加,激活蛋白激酶C(protein kinase C ,PKC),进而抑制胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1 IRS-1)活性,干扰胰岛素信号传导系统,减低葡萄糖的转运,导致胰岛素抵抗的形成。PGC-1α作为重要的核转录共激活因子是否在高脂导致的线粒体功能变化、胰岛素抵抗中发挥重要作用,其机制是什么,目前国外尚无定论,国内鲜有报道。 本课题通过高脂饮食喂养老年大鼠,造成胰岛素抵抗模型,分析胰岛素抵抗状态下和罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)干预后骨骼肌线粒体相关蛋白PGC-1α,mfn2、NRF-1的表达变化及相关关系,分析高脂饮食喂养老年大鼠线粒体功能和胰岛素敏感性的变化。采用脂肪酸孵育C2C12肌细胞,了解不同类型脂肪酸对骨骼肌PGC-1α表达的影响,寻找细胞水平研究PGC-1α作用机制的模型,并通过药物和小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)技术调节肌细胞PGC-1α的表达,分析线粒体相关蛋白和胰岛素信号通路相关蛋白的表达变化,探讨PGC-1α在高脂、线粒体功能和胰岛素抵抗中的作用机制及其上游调控因子,为研发防治胰岛素抵抗和2型糖尿病的药物提供新的作用靶点和理论依据。本实验内容主要包括以下四部分: 第一部分高脂诱导老年胰岛素抵抗大鼠骨骼肌线粒体相关蛋白的表达 目的:测定高脂饮食喂养及罗格列酮干预老年大鼠的胰岛素敏感性以及骨骼肌PGC-1α、Mfn2和NRF-1的表达变化,探讨高脂与线粒体功能、IR的关系。 方法:22-24月龄老年雄性Wistar大鼠40只随机分为2组:老年对照(OC)组16只、老年高脂(OF)组24只, 4-5月龄青年大鼠16只,为青年对照组(YC)。对照组给予基础饲料,热量组成:碳水化合物65.5%,脂肪10.3%,蛋白质24.