324-390),其亲和指数Kd值约2nM,表明其亲和力较差。另外,scFv78分子量小,容易经肾脏排泄,血浆半衰期短,限制了其在早期特异性诊断和治疗等方面的应用。 本实验为了提高TEM1特异性抗体的亲和力与延长其在血液中的半衰期。我们构建了一系列新的scFv78多价抗体衍生物,包括二聚体Fc融合蛋白(来自hu
IgG1)(78Fc),四聚体CH2融合蛋白(78CH2),二聚体CH3融合蛋白(78mb)和二聚体的CH1-铰链区融合蛋白(78F(ab’)2),以便从中发现温度稳定和血清稳定性更好以及亲和力更高的抗体；通过瞬时转染293F细胞并且对培养上清进行亲和纯化获得这些蛋白；利用活细胞ELISA对这些蛋白进行亲和力的分析；同时,在动物体内对上述5个蛋白的血液代谢动力学进行检测；并利用近红外荧光成像技术对筛选出的最佳候选蛋白进行了体内成像检测,利用细胞杀伤实验和成管实验,观察其体外选择性地杀伤TEM1阳性表达细胞的效果。实验结果显示：与我们前期工作发现的scFv78相比,本实验构建的78Fc亲和力(Kd=0.14±0.01nM)增加了约15倍；动物体内代谢动力学结果表明78Fc的慢相半衰期约5.1小时；体内功能分析表明78Fc不针对Naive鼠的正常器官,而只是针对体内TEM1+肿瘤；近红外荧光成像技术结果显示78Fc在鼠体内只靶向TEM1阳性表达的细胞；最后78Fc-MMAE可以在体外选择性地杀伤TEM1阳性表达细胞。
3-Methyladenine浓度 综上所述,我们可以初步认为,通过将scFv78和Fc段融合后,提高了该蛋白的稳定性及亲和力,血液动力学结果表明78Fc有相对长的血清半衰期,可以用来做成像的探针。体内近红外荧光成像技术,体外细胞杀伤实验与成管实验与也证实其具有较高的特异性。因此,我们认为TEM1是一个成像与治疗的候选基因,可能为卵巢癌和其它癌症的靶向诊断与治疗提供新的思路；而78Fc可以为卵巢癌的早期诊断和治疗提供可能。
目的： 通过沉默或激活PC-9细胞(携带EGFR基因19外显子突变的NSCLC细胞株)中的内源性FGF2表达,同时添加吉非替尼与外源性FGF2,诱导PC-9细胞产生针对EGFR-TKIs快速获得性耐药的状态,筛选出FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的细胞模型,以进一步明确FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药这一全新的耐药模式中所涉及的分子机制。 研究方法： 1.构建编码靶向FGF2基因shRNA及基于PAS (PCR-based Accurate Synthesis)的慢病毒载体,包装慢病毒,感染人肺癌细胞PC-9,以荧光定量PCR检测FGF2基因在mRNA水平的变化,以western blot检测FGF2蛋白表达水平的变化,筛选出FGF2沉默表达/高表达的细胞株； BMN673 2.PC-9细胞针对EGFR-TKIs快速获得性耐药状态的诱导及鉴定：对FGF2沉默表达(PC-9-FGF2-KD)或过表达细胞株(PC-9-FGF2-OE)单用吉非替尼或联用外源性FGF2,筛选出耐药细胞株。进一步用相关的生物学指标验证其耐药属性,生物学指标检测包括：(1)以MTS法检测细胞增殖情况；(2)以AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒检测时的细胞凋亡情况,以PI单染法检测细胞周期分布情况；(3)软琼脂实验测定细胞锚定非依赖生长的影响；(4)Transwell法测定细胞迁移和侵袭能力；(5)实时荧光定量PCR法检测获得性耐药相关突变T790M突变和cMET扩增拷贝数。
Selleckchem SB 715992 3.以Affymetrix人全基因组3′IVT芯片检测PC-9-NC+FGF2、PC-9-FGF2-KD+FGF2、PC-9-FGF2-OE+FGF2,以及空白对照的PC-9细胞的差异基因表达改变。 结果： 1.采用慢病毒载体介导的转基因方法构建了FGF2基因沉默和FGF2基因高表达的PC-9细胞,Western Blot检测进一步在蛋白水平对细胞内FGF2的表达改变进行了验证,成功筛选出稳定的FGF2基因沉默(PC-9-FGF2-KD)和FGF2基因高表达(PC-9-FGF2-OE)的PC-9细胞株； 2.在FGF2基因过表达的PC-9细胞株(PC-9-FGF2-OE)及给予外源性FGF2的PC-9细胞株中均观察到细胞活力的增加,提示内外源性的FGF2刺激均有可能诱导出PC-9细胞针对EGFR-TKIs的快速获得性耐药；细胞生物学检测进一步表明PC-9-FGF2-OE+FGF2细胞株中出现显著的细胞凋亡率下降、细胞增殖分裂加快、细胞迁移和侵袭能力增强等耐药生物学行为,证实该细胞模型为FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的稳定的NSCLC细胞模型； 3.芯片检测发现PC-9-FGF2-OE+FGF2组细胞与PC-9-NC+FGF2组相比较而言,主要产生了PI3K-AKT通路、MAPK通路、ErbB通路和VEGF通路的上调,其中PI3K-AKT信号通路对FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的发生机制可能具有重要意义。 结论： 1.成功构建出FGF2介导的EGFR-TKIs快速获得性耐药的稳定的NSCLC细胞模型,为进一步揭示FGF-2信号通路介导EGFR-TKIs快速获得性耐药的分子机制奠定了研究基础； 2.