目的 为获得具有体外切割活性的LbCpf1蛋白。方法 将毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)的LbCpf1基因编码区连接至pHis*6(IV),构建原核表达质粒CRISPR-LbCpf1-6*His。将该重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,经镍柱亲和层Apitolisib 买析纯化、透析除盐和凝胶电泳检测等步骤获得重组蛋白,进行体外切割试验鉴定重组蛋白切割活性。结果 双酶切鉴定和测序结果表明成功构建重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His,经转化后获得含有重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His的BL21(DE3)蛋白表达菌株。将菌株接种于37℃,160 r/min,IPTG终浓度为0.Nintedanib体外5 mmol/L的条件下诱导5 h,最终镍柱纯化除盐后的LbCpf1蛋白终浓度可达400 ng/μl,在体外适宜条件下,该重组蛋白可与成熟的crRNA结合切断标靶DNA。结论 获得的高纯度LbCpf1蛋白具有体外切割活性,可用于后续基因编辑研究。
细胞DNA的完整性受到不同因素的影响,可分为内源性及外源性因素,这些因素均可LBH589 价格引起不同程度的DNA损伤。其中,DNA双链断裂是最严重的一种DNA损伤,若未能进行及时的修复,则会引起一系列的损伤反应。严重的DNA双链断裂甚至可以造成细胞凋亡、肿瘤的发生等严重后果。因此,快速并准确地检测细胞DNA双链断裂程度能帮助评估DNA的完整性、内外环境的遗传毒性效应、临床诊断和放化疗监测。DNA双链断裂检测技术近年来发展迅速,目前可基于物理或化学方法、免疫荧光法和高通量测序技术检测DNA双链断裂程度。