吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞细胞因子表达RT-PCR的方法检测了小胶质细胞经吗啡(10μM)处理后TNFαIL-1β和IL-6 mRNA的表达,发现小胶质细胞中上述三种细胞因子表达明显增加,较未处理组有显著差异。纳洛酮可阻断吗啡的作用。 Androgen Receptor Antagonist小白鼠 结论 1.吗啡通过阿片受体途径激活并诱导小胶质细胞细胞因子的表达。 2.吗啡通过阿片受体途径诱导小胶质细胞凋亡,caspase-3途径介导了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。 第二部分GSK3β信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用研究 目的 使用体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系探讨GSK3β信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用及其具体机制。
方法 1.体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理 体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,5,10,20 u M)；2.正常对照组、吗啡组(6h,12h,24h) 3.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；4.正常对照组、吗啡组、SB216763组(10μM)、吗啡+SB216763组(SB216763提前1h加入)。置细胞培养箱孵育。 2. Western Blotting 使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-Akt、phosphor-GSK3β、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、phosphor-p38、Bax、Bcl-2等蛋白水平变化。 3.细胞凋亡的检测 使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。 4. RT-PCR 使用RT-PCR检测小胶质细胞Bax和Bcl-2 mRNA水平变化。 结果 1.吗啡通过阿片受体途径使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3β蛋白水平降低 Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3p蛋白水平明显降低,且表现为时间和剂量依赖性,纳洛酮可阻断吗啡的作用。 2.抑制GSK3β增加吗啡诱导的小胶质细胞凋亡 TUNEL方法检测细胞凋亡,发现特异性GSK3β抑制剂SB216763预处理显著增加了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。Western Blot方法检测小胶质细胞cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平,发现SB216763预处理可以明显增加吗啡引起的caspase-3和caspase-8活化。 3.抑制GSK3β使吗啡处理引起的Bax/Bcl-2和phosphor-p38变化增加 Western Blot方法检测小胶质细胞Bax和Bcl-2蛋白水平变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax水平升高,Bcl-2水平降低。而SB216763预处理增加了吗啡引起的Bax/Bcl-2变化。RT-PCR方法检测小胶质细胞中Bax和Bcl-2
mRNA表达变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax mRNA水平升高,Bcl-2 mRNA水平降低,而SB216763预处理增加了吗啡引起的Bax/Bcl-2 mRNA变化,与蛋白变化一致。Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-p38水平,发现吗啡处理使小胶质细胞phosphor-p38水平升高,纳洛酮可阻断吗啡的作用。而SB216763预处理可显著增加吗啡引起的phosphor-p38升高。
结论 1.吗啡通过阿片受体途径使小胶质细胞phosphor-Akt和phosphor-GSK3β蛋白水平降低。 2.抑制GSK3β增加吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。 3.抑制GSK3β增加吗啡引起的Bax/Bcl-2水平变化。 已经 4. GSK3β对Bax和Bcl-2的表达调控发生在转录水平。 5.抑制GSK3β可增加吗啡处理引起的phosphor-p38水平升高。 第三部分P38 MAPK信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用研究 目的 使用体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系探讨p38 MAPK信号通路在吗啡诱导小胶质细胞凋亡中的作用及其具体机制。 方法 1.体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理 体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(10u M)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；2.正常对照组、吗啡组、SB203580组(10μM)、吗啡+SB203580组(SB203580提前1h加入)；置细胞培养箱孵育。 有 2. Western Blotting 使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-p38、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、Bax、Bcl-2等蛋白水平变化。 3.细胞凋亡检测 使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。 4. RT-PCR 使用RT-PCR方法检测小胶质细胞Bax和Bcl-2 mRNA水平变化。 结果 1.吗啡处理使小胶质细胞phosphor-p38蛋白水平升高 Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞phosphor-p38水平升高,而纳洛酮可阻断吗啡的作用。 2.抑制p38 MAPK减少吗啡诱导的小胶质细胞凋亡 TUNEL方法检测细胞凋亡,发现p38 MAPK特异性阻滞剂SB203580预处理明显减少了吗啡诱导的小胶质细胞凋亡。Western Blot方法检测小胶质细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平,发现SB203580预处理可以明显减少吗啡引起的caspase-3和caspase-8活化。 3.抑制p38 MAPK减少吗啡处理引起的Bax/Bcl-2变化 Western Blot方法检测小胶质细胞中Bax和Bcl-2蛋白水平变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低。而SB203580预处理减少了吗啡引起的Bax/Bcl-2蛋白变化。RT-PCR方法检测小胶质细胞中Bax和Bcl-2 mRNA表达变化,发现吗啡处理使小胶质细胞Bax mRNA水平升高,Bcl-2 mRNA水平降低。而SB203580预处理减少了吗啡引起的Bax/Bcl-2 mRNA变化,与蛋白变化趋势一样。 结论 1.吗啡通过阿片受体途径增加小胶质细胞phosphor-p38水平。 2.抑制p38减少吗啡诱导的小胶质细胞凋亡 3.抑制p38减少吗啡处理引起的Bax/Bcl-2变化。4.