01uM/L、0.1uM/L、1uM/L、10uM/L)作用于小鼠MC3T3-E1细胞,应用MTS法检测各组细胞存活率,筛选出对小鼠MC3T3-E1细胞有明显抑制且呈剂量依赖性的抑制剂。 2、选取其中S1021(Dasatinib)(靶点为SRC/ABL)、S1111(XL880(GSK1363089))(靶点为MET/VEGFR)两种抑制剂,分别以0.5uM/L作用于小鼠MC3T3-E1细胞,运用FACS法检测各周期(Sub-G1,G1, S, G2/M)细胞百分比,分析抑制剂对成骨细胞增殖周期的影响。 3、运用western blot检测抑制剂作用后MC3T3-E1细胞CCND1、P53、AKT、 P-AKT及BAX的表达。
结果1、通过MTS法共筛选出7种抑制剂,可以显著抑制小鼠MC3T3-E1细胞的增殖,且抑制效果呈剂量依赖关系。七种抑制剂为：S2703(GSK1838705A)、 S2743(PF-04691502)、S1021(Dasatinib)、S1064(Masitinib)、S1065(GDC-0941)、 S1111(XL880)、S1120(Everolimus)。 2、以0.5uM/L的抑制剂S1021(Dasatinib)、S1111(XL880)分别作用于小鼠MC3T3-E1细胞。与对照组比较,S1021组Sub-G1细胞比例显著增高(P=0.00)；S1111组Sub-G1期细胞比例显著升高(P=0.01),且两组药物间无显著差异(P=0.26)。 点击此处 3、与对照组比较,S1021可以抑制CCND1的表达,且可降低P-AKT的水平,对于P53及BAX的表达无明显影响。S1111可以抑制CCND1的表达,而对P-AKT、P53及BAX表达无明显影响。 结论：抑制SRC/ABL可以通过抑制AKT的磷酸化并下调CCND1抑制成骨细胞MC3T3-E1的增殖,抑制VEGFR/MET可以通过下调CCND1抑制成骨细胞增殖,说明SRC/ABL通过依赖AKT磷酸化的信号通路在成骨细胞增殖过程中起到关键作用。VEGFR/MET受体介导的信号通路在成骨细胞增殖中同样发挥重要作用,且其介导成骨细胞增殖过程不依赖于AKT的磷酸化。
大量研究表明,原癌基因RET和Hedgehog Y-27632数据表 (Hh)信号通路的异常表达均与发育和肿瘤的发生发展密切相关,但RET是否调控Hh通路却鲜有报道。基于以上疑问,本研究首先借助Hh靶基因Gli-1的双荧光素酶报告基因系统,发现内源表达RET的成神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y经RET蛋白激活物胶质细胞源性神经营养因子(Glial
cell-line derived neurotrophic factor, GDNF)处理,Gli-1报告基因的活性增加。进一步在293T细胞和SH-SY5Y细胞中共转RET过表达质粒和Gli-1报告基因质粒,发现在这两种细胞系中过表达RET均可增加Gli-1报告基因活性,证实RET参与调控Hh通路。过表达RET下游分子Akt的激活形式可增加Gli-1报告基因活性。而使用MK-2206抑制Akt活性或慢病毒敲降Akt后,激活RET并不能上调Gli-1的mRNA水平,证实RET通过Akt调控Hh通路。进一步,为研究Hh通路中的哪个分子是RET调控的靶点,我们利用Cyclopamine特异性抑制该通路的关键分子Smoothened (SMO)的活性,发现激活RET依然能增加Gli-1的mRNA水平,提示RET可能作用于膜受体SMO的下游。通过对SMO下游相关分子PKA、GSK3β、CK1的磷酸化水平检测,发现激活RET或Akt能降低GSK3β的磷酸化。因GSK3β负向调控Hh通路,抑制GSK3β则可激活Hh通路,且该作用不受MK-2206或RET敲降影响,提示RET/Akt可通过抑制GSK3P活性来激活Hh通路。最后,细胞增殖试验表明,RETshRNA.MK-2206以及Cyclopamine处理SH-SY5Y细胞,都能抑制该肿瘤细胞的增殖能力。综上所述,本研究初步证明RET可通过激活Akt,进而抑制GSK3β的磷酸化,最终激活Hh通路来影响肿瘤细胞的增殖水平。
本文比较了黄芩苷和黄芩苷铜对人肝癌细胞(HepG-2)裸鼠移植瘤生长的影响,并采用免疫印迹分析癌细胞凋亡相关蛋白的表达以研究黄芩苷铜对人肝癌细胞株HepG-2增殖、凋亡的影响,初步探讨其作用机制。构建HepG-2细胞裸鼠异种移植瘤模型,分析黄芩苷铜对人肝癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。将裸鼠随机分为4组：对照组、50mg/kg黄芩苷组、50mg/kg黄芩苷铜组、100mg/kg黄芩苷铜组。各组每天肌肉注射给药相应剂量并测量绘制肿瘤的生长曲线,32天后处死动物,称重瘤块和计算抑瘤率以评价黄芩苷铜和黄芩苷处理对HepG-2细胞裸鼠异种移植瘤的影响。利用MTT法分析黄芩苷铜对于HepG-2细胞增殖的抑制作用。采用AO染色及荧光显微镜观察经黄芩苷铜作用后,人肝癌HepG-2细胞中凋亡肝癌细胞的形态学变化。利用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率。采用PI单染流式细胞仪分析细胞周期的分布,观察黄芩苷铜对HepG-2细胞的诱导凋亡作用；采用Western
没有 blot分析黄芩苷铜对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白、caspase-3、Bax、p38、和Bcl-2蛋白表达的影响。肌肉注射黄芩苷和黄芩苷铜32天后,黄芩苷剂量为50mg/kg、黄芩苷铜剂量为50mg/kg和100mg/kg时,瘤块重量分别为0.69±0.11g,0.6±0.17g和0.40±0.07g均明显低于对照组(P
目的:通过观察Akt特异性抑制剂API-2和MK2206对小鼠1-细胞胚体外发育的影响及Akt特异性抑制剂对体外发育2-细胞胚内Akt主要活性形式p-Ser473-Akt定位与表达的改变,结合Akt特异性抑制剂API-2对小鼠合子基因组激活(Zygotic Gene Activation,ZGA)中四个标志基因和干细胞因子Oct4与Sox2的表达影响,为进一步探讨Akt在小鼠植入前胚发育ZGA中可能发挥的作用提供基础。方法:1.收集KM小鼠体内植入前胚(1-细胞胚至4-细胞胚),应用免疫荧光技术观察细胞内p-Ser473-Akt和总Akt(pan-Akt)的表达与定位情况。2.收集KM雌性小鼠与KM雄性小鼠交配所得的1-细胞胚,分别观察其在KSOM培养液、不同浓度的API-2和MK2206的KSOM培养液中体外发育的情况;3.收集KM小鼠1-细胞胚,分别置于KSOM和含API-2(2μM)和MK2206(30μM)的KSOM培养液中培养,获取体外发育的2-细胞胚,采用免疫荧光技术观察细胞内p-Ser473-Akt和pan-Akt的定位与表达情况;4.