5μ mol/L GDC-0941)及联合Ⅱ组(5.0μ mol/L AZD6244+5.0μ mol/L GDC-0941)。细胞经过不同组合浓度的抑制剂作用后,MTT法绘制增殖抑制曲线；平板集落形成法检测集落形成能力的改变；流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布；Western blot检测不同组中抑制剂靶点下游周期及凋亡相关蛋白表达的差异。 在两株NSCLC细胞中,单独抑制RAS/RAF/MEK通路或PI3K/AKT/mTOR通路效果较差。抑制剂AZD6244或GDC-0941作用于A549细胞的抑制率分别可达25.5%和38.1%,作用于NCI-H157细胞的抑制率分别可达16.9%和35.1%。Westernblot结果显示AZD6244抑制RAS/RAF/MEK通路后(降低pERK活化)激活PI3K/AKT/mTOR通路(增强pAKT活化)。相反,GDC-0941抑制PI3K/AKT/mTOR通路后激活了RAS/RAF/MEK通路。结果表明单通路突变的细胞,仅抑制该突变通路,效果差。未突变通路的抑制剂对肺癌细胞的增殖也有抑制作用。无论肺癌细胞是KRAS单突变,还是KRAS/PTEN双突变,单通路抑制效果较差,需要双通路联合抑制提高疗效。 RAS/RAF/MEK和PI3K/AKT/mTOR双通路联合抑制可增强KRAS/PTEN双突变的NSCLC细胞的生长抑制作用。在NCI-H157细胞中,低剂量的联合Ⅰ组表现为两药协同作用(q值=1.22),高剂量的联合Ⅱ组表现为两药相加作用(q值=0.92)；集落形成能力下降[77.2±1.54个/孔VS61.5±2.12个／孔,P<0.01]；凋亡率增加[18.3±0.82%VS21.32±0.56%,P<0.01]和[27.14±1.58%VS42.45±4.42%,P<0.01]；凋亡率显著增加[37.85±3.18%VS52.27±4.36%,P
研究背景及意义

DNA Methyltransferase inhibitor体内 银配合物已经被研究证明具有抗菌、抗肿瘤特性。单质子化的脱氢脱甲基斑螯酸银配聚物(Ag-SP-DNC)是我们合作课题组在前期的实验研究中新合成的银配聚物。在这项研究中,我们得到的实验结果表明Ag-SP-DNC是通过活性氧(ROS)介导的线粒体依赖性细胞凋亡通路导致肺癌细胞发生凋亡。Ag-SP-DNC对人非小细胞肺癌细胞A549有生长抑制作用,将细胞周期抑制于G2/M期,导致细胞发生凋亡。Ag-SP-DNC引起细胞发生凋亡是与细胞内活性氧(ROS)的水平密切相关。进一步研究证明Ag-SP-DNC可破坏细胞线粒体膜电位,诱导caspase-3活化促使凋亡诱导因子AIF、EndoG从线粒体转移到细胞核诱导细胞发生凋亡。这个研究的意义在于为开发银化合物为新的抗肿瘤药物提供实验依据。 方法 1.常规复苏、培养人非小细胞肺癌细胞株A549细胞至对数生长期备用。 2.MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测细胞生存率。 3.SRB(磺酰罗丹明B)法检测细胞存活率。 或者 4.PI单染流式细胞术检测细胞周期情况。 5. DTNB[二硫代二硝基苯甲酸]法检测细胞内GSH水平。 6.倒置显微镜下观察A549细胞形态学变化。 7. TRITC—鬼笔环肽标记扫描共聚焦显微镜观察细胞微丝骨架。 8. Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡率。 9.JC-1标记流式细胞仪分析细胞线粒体膜电位。 10.荧光探针DCFH-DA进行细胞内活性氧水平检测 11.caspase-3(Asp175) antibody (Alexa fluor488conjugate)标记流式细胞术检测细胞内caspase-3活化水平。

12.Fluo-3/AM标记流式细胞术检测细胞内游离Ca2+水平。 13. Western blot检测细胞内AIF, EndoG, Bcl-2, P53等凋亡相关蛋白表达。 14.实验结果采用SPSS16.0软件进行Student’s T test, P<0.05表示有显著差异,P
恶性肿瘤正成为威胁人类生命健康的头号疾病。目前临床上应用的直接作用于细胞有丝分裂、DNA合成和修复等过程的传统细胞毒类药物存在选择性低、毒性大等缺点。因此,以与肿瘤细胞分化增殖相关的细胞信号通路的关键酶作为药物筛选靶点,寻找选择性作用于特定靶点的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研发的重要方向。这些小分子抑制剂与传统的肿瘤治疗药物相比往往具有更好的疗效和较小的毒副作用。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinase, 确认细节 PI3K)是细胞生命活动中的关键信号分子。PI3K介导的信号通路是细胞内重要信号转导通路之一,通过影响下游多种效应分子的活化状态,控制着细胞生长、增殖、存活、分化、调亡、转移、代谢、转录和翻译等多种细胞生物学过程。大量研究表明PI3K/Akt信号通路与人类多种肿瘤的发生发展密切相关。以该信号通路中关键酶为靶点的抗肿瘤药物研究成为肿瘤预防和肿瘤靶向治疗的热点之一。 BENC-511是本研究室发现的3-硝基-2H-苯并吡喃类抗肿瘤衍生物,在体内外均表现出良好的抗肿瘤活性。BENC-511的药理学特点主要表现为：1)通过作用于PI3K/Akt信号通路,抑制肿瘤细胞中Akt的磷酸化及下游蛋白mTOR/p70S6K、4E-BP-1的表达；2)通过诱导肿瘤细胞凋亡相关蛋白PARP的裂解,活化caspase-3,诱导肿瘤细胞的凋亡；3)在体外,BENC-511对包含血液瘤、固体瘤等10余种肿瘤细胞的生长均有较强的抑制作用；4)在多发性骨髓瘤(OPM2, RPMI-8226)异种移植模型中,小鼠口服给药50mg/kg/d,连续给药20天,与对照组相比,BENC-511对肿瘤生长的抑制率高达75%以上,而对小鼠肝脏酶、血液生化指标等没有影响,未观察到任何毒副作用。因此,BENC-511是一个靶向作用于PI3K/Akt通路、具有良好抗肿瘤活性和较低毒性的好的苗头化合物。 为了寻找抗肿瘤活性和选择性更好的3-硝基-2H-苯并吡喃类化合物,我们以BENC-511为先导化合物,以计算机辅助药物设计方法为指导,结合PI3K激酶以及下游信号通路关键酶的三维结构对其进行结构修饰,确定6位为主要的结构修饰位点。我们以氨基取代6位的溴,然后在伯氨基上引入不同的酰基侧链,设计了一系列酰胺衍生物。以3-乙氧基水杨醛为起始原料,经硝化,醛基、酚羟基保护,钯-碳催化氢化还原,氨基Boc保护,醛基脱保护以及环合反应得到6-叔丁氧甲酰氨基-3-硝基-8-乙氧基-2H-苯并吡喃关键中间体。在酸性条件下脱掉氨基的Boc保护基,与不同取代的羧酸,在EDCI/HOBt的经典条件下,缩合得到目标化合物。 本研究共合成BENC-511类似物24个,并对其抗肿瘤活性做了初步研究。体外细胞(K562, DU145和Hela)活性筛选试验结果显示,这一系列化合物对白血病K562细胞和前列腺癌DU145细胞均表现出较好的抑制活性,对子宫颈癌Hela细胞抑制活性较弱。其中,化合物KGS-19、KGS-22和KGS-24具有良好的抗肿瘤活性,对K562细胞的IC50值分别为0.53、0.43和0.