实验动物来源：过表达人类Hsp27B基因的转基因鼠(Hsp27B transgenic mice,Hsp27 Tg)由本课题组、南京大学模式动物研究所共同构建,饲养于南京大学模式动物研究所的SPF级动物房中。2.心脏质量检测：称量并计算心脏重/体重比(Heat Weight/Body Weight, HW/BW)和心脏重/胫骨长比(heat
weight/tibialength,HW/TL),组织切片比较二尖瓣平面心脏大小。3.心功能及心脏结构检测：1)超声心动图检测左室射血分数(ejection 点击此处 fraction,EF%)及左室缩短率(fractional shortening,FS%)代表心功能；2)左室重构指标：舒张期/收缩期室间隔厚度(interventricular septal thickness at diastolic/systolic phase,IVSd/IVSs)、舒张期/收缩期左室内径(left ventricular internal diameter at diastolic/systolic phase, LVIDd/LVIDs)、舒张期/收缩期末期左室容积(left ventricle end-diastolic/systolic volume, LVVd/LVVs),左室质量(left ventricular mass,LV mass)。4.荧光定量PCR分析ATP能量代谢相关基因mRNA表达水平；心肌组织ATP含量测定。5.组织学及蛋白质印迹检测：1) 电镜观察心肌超微结构改变；2)心肌组织学检测：HE染色、免疫组化；3) Western Blot检测心肌蛋白质聚集；6. 心肌自噬水平检测及相关机制的研究：1) 电镜观察心肌自噬体数量；2) Western Blot检测LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、hVps34,Bcl-2、p-ERK/ERK;3) TUNEL检测心肌凋亡。结果：1.根据Hsp27表达水平的高低,将转基因小鼠分为两个转基因系,表达量较高的Tg10转基因系、表达量中等的Tg85转基因系。2.与野生型鼠相比,高表达Hsp27的转基因小鼠的心脏重／体重比(HW/BW)、心脏重/胫骨长比(HW/TL)增高；二尖瓣平面心脏肥大；而野生型小鼠和低度表达Hsp27的转基因小鼠HW/BV及HW/TL无统计学差异。3.与WT及Tg85小鼠相比,Tg10小鼠EF%及FS%明显降低(P<0.05或0.01)；IVSd(P<0.01)、LVIDd(P<0.05)、LVIDs(P<0.01)、LVVd(P<0.01)。4.逆转录PCR检测线粒体能量代谢基因mRNA水平,明显低于WT(P<0.01或0.05),Bcl-2显著下调(P
目的：本实验旨在探讨晚期糖基化产物(advanced
selleck激酶抑制剂 glycation end products, AGEs)对心肌细胞自噬水平的影响及自噬在AGEs诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法：AGEs处理SD乳鼠原代心肌细胞,Western blot检测蛋白表达水平,透射电镜观察自噬小体,MTT实验检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果：与对照组相比较,AGEs处理原代心肌细胞后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达水平上调,SQSTM1/P62水平下降,电镜观察到自噬小体数量增多；AGEs处理组心肌细胞凋亡率升高,细胞活性降低。而用自噬抑制剂3-MA预处理后AGEs处理组细胞凋亡率进一步升高,细胞活性更低。AGEs能活化ERK、JNK和P38MAPK信号通路,并且抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路。ERK抑制剂PD98059或Akt激活剂胰岛素样生长因子-1(IGF-1)预处理能抑制AGEs诱导的心肌细胞自噬,而P38抑制剂SP600125或IGF-1预处理后能抑制AGEs诱导的心肌细胞凋亡。结论：本实验以乳鼠原代心肌细胞为对象,研究了AGEs对心肌细胞自噬与凋亡的影响。AGEs通过PI3K/AKT/mTOR和ERK/MAPK信号通路诱导心肌细胞自噬,通过PI3K/AKT/mTOR和P38/MAPK信号通路诱导心肌细胞凋亡。证明自噬在晚期糖基化产物诱导心肌细胞凋亡中具有保护作用。
急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是由非心源性的各种肺内和肺外致病因素引起的急性进行性缺氧性呼吸衰竭,病情进一步发展将形成急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory 还有 distress syndrome, ARDS),最终引发多器官功能障碍,是临床常见病、多发病。由于对疾病发生发展过程认识的不足,目前临床对于改善ARDS患者严重的顽固性低氧血症的措施十分有限,现在依然没有理想的治疗手段,ARDS病死率始终居高不下。因此研究疾病的发病机制,在治疗ALI/ARDS、改善疾病的预后中显得尤为重要。ARDS发病机制错综复杂,研究表明其机制可能与机体正常炎症反应的过度激活有关。参与这种过度炎症的包括多种炎症细胞以及炎症介质。当炎症细胞接触到外源性、内源性刺激时会引起自身激活,同时释放更多的炎性因子使更多的细胞发生激活,这一细胞激活的过程与膜蛋白的活化有密切的联系。膜蛋白活化的一种重要的修饰方式是异戊二烯化修饰。常见的真核细胞中异戊二烯化修饰主要有香叶烯基化(GGPP修饰)和法尼烯基化(FPP修饰)两种,GGPP与FPP均来源于甲羟戊酸途径。既往研究发现使用他汀类(statins)药物即羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制齐(HMG-CoA
reductase inhibitor)有缓解炎症的作用,但具体作用原理尚不明确,其中的一种可能性猜测是他汀类对下游GGPP和FPP的合成发生抑制,减少了膜蛋白异戊二烯化,从而对炎症的进展起到抑制作用。本研究小组前期研究已证实在ARDS病程中肺泡上皮细胞内GGPPS1表达水平发生改变,且GGPPS1表达水平的变化程度与肺部炎症水平有直接相关性。查阅文献,在SCI中尚未有报道表明此改变在炎症细胞中的变化及作用。在众多炎症细胞中,单核巨噬细胞在炎症早期阶段即发生激活,并能释放多种炎症因子,在炎症的进程中发挥重要的作用。因此本文主要针对ARDS病程中外周血单核巨噬细胞内GGPPS1表达水平的变化及作用进行探索研究。通过本文的研究我们发现：1.在ARDS病人或内毒素(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤模型中外周血单核巨噬细胞内GGPPS1表达显著增高；2.体外实验中发现LPS通过TLR-4/p38/MAPK途径在鼠源巨噬细胞系(Raw264.7)和人源巨噬细胞系(THP-1)中引起GGPPS1表达增高。3.