6±0.4×106。各种病毒载体对视网膜细胞的亲嗜性不尽相同,但都能有效转导RPE细胞。在活体视网膜细胞中,Ad5-EGFP、Ad5/F35-EGFP和LV-EGFP介导的GFP表达与其主要受体CAR、CD46和CD4的在视网膜内的分布不完全一致,仅rAAV2感染细胞的类型与HSPG阳性细胞分布基本一致。 【结论】5种病毒载体对视网膜细胞的转导效率、基因表达和亲嗜性各有特点,在实际应用中,应根据疾病的性质、受累细胞的类型和病程特点等,有针对性的选择合适的载体。 【目的】研究提高rAAV2对视网膜细胞的转导效率及基因表达水平的新方法,并初步探讨其可能的机理,改善眼底病基因治疗的效果。【方法】采用低剂量腺病毒或不同浓度的化疗药物与携带报告基因EGFP或LUC的rAAV2联合感染人hRPE细胞株、原代培养的成人RPE、IPE细胞以及原代培养的SD大鼠视网膜神经细胞。通过荧光显微镜、Western

selleck产品 blot、流式细胞仪等方法观察GFP表达,荧光定量PCR和RT-PCR检测GFP的DNA拷贝数和mRNA表达丰度,以及AAV2的受体HSPG、FGFR-1、ανintegrin mRNA等的表达水平是否发生变化。rAAV2-LUC或rAAV2-GFP单独或联合腺病毒或化疗药物注射到Balb/c小鼠或SD大鼠视网膜下,小动物活体成像或荧光体视镜观察LUC及GFP表达、分布及持续时间。用TUNEL方法检测视网膜原位凋亡。rAAV2- CNTF单独或联合腺病毒或化疗药物注射到遗传性视网膜变性的RCS大鼠视网膜下,HE染色观察并计数RCS大鼠视网膜外核层中细胞的层数和数量。【结果】荧光显微镜、Western blot、流式细胞仪等检测结果均表明,低剂量腺病毒和化疗药物可以在体外提高rAAV2对RPE及视网膜神经细胞的转导效率和外源基因表达水平。其中低剂量腺病毒可使外源基因的蛋白表达水平提高1-5倍,mRNA表达水平提高3-5倍;化疗药物可使外源基因的蛋白表达水平提高10-20倍,mRNA表达水平提高9-27倍。但两者均不改变GFP的DNA拷贝数。化疗药物或腺病毒与rAAV2联合感染RPE细胞时,可使AAV2相关的细胞表面受体的mRNA表达水平轻微上调。体内实验表明rAAV2-CMV-GFP联合低剂量腺病毒或化疗药物注射到SD大鼠视网膜下,可以加快并提高GFP在视网膜内的表达。单纯注射rAAV2-CNTF、或联合1×104复制缺陷型腺病毒或联合0.1μg/ml阿霉素注射后8周计数RCS大鼠外核层残存的光感受器细胞层数(每微米)分别为X=3.96±0.16、为X=5.25±0.21和X=8.05±0.28,联合应用组与单独使用组比较p值均小于0.05。应用低剂量腺病毒时视网膜组织未见明显的免疫反应,应用化疗药物时视网膜细胞未见凋亡增加。【结论】低剂量腺病毒或化疗药物可以有效提高rAAV2对视网膜细胞的转导效率和基因表达水平,并改善基因治疗效果。腺病毒或化疗要药物可能是在转录水平上提高rAAV2介导的基因的表达水平的。此外,这种方法也是安全的。

【目的】研究化疗药物对2型腺相关病毒载体和复制缺陷型腺病毒载体对肿瘤细胞的外源基因表达的影响,并初步探讨可能的作用机理。为进一步研究化疗药物与基因治疗的相互作用和关系,以及提高肿瘤基因治疗的效果提供实验证据。 GSK1120212 价格 【方法】采用rAAV2-GFP或Ad5-GFP单独或联合不同浓度的化疗药物感染NCI-H446、NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SK-BR-3、BTT、KB和KB/VCR等肿瘤细胞。采用荧光显微镜、Western blot、流式细胞仪检测GFP表达,荧光定量PCR和RT-PCR检测GFP的DNA拷贝数和mRNA表达的丰度,以及病毒受体HSPG、FGFR-1、ανintegrin mRNA表达。Ad-GMCSF单独或联合化疗药物感染NCI-H460、A549、SMMC-7721、SGC7901、SK-OV-3和BTT后,ELISA方法检测培养液中GMCSF含量。小动物活体成像观察Ad5-RFP单独或联合化疗药物感染T739小鼠体内生长的肿瘤后RFP荧光。【结果】荧光显微镜、Western blot、流式细胞仪等检测结果均表明,化疗药物可以提高rAAV2-GFP和Ad5-GFP在多种肿瘤细胞中的表达水平。可使Ad5-CMV-GFP介导的外源基因的蛋白表达水平提高10-20倍,mRNA表达水平提高8-10倍;可使rAAV2-GFP介导的外源基因的蛋白表达水平提高1-5倍,mRNA表达水平提高15-25倍。但GFP的DNA拷贝数没有明显改变。化疗药物联合rAAV2感染肿瘤细胞后细胞表面受体的mRNA表达水平有轻微上调。Ad-GMCSF联合化疗药物感染肿瘤细胞后可以提高GMCSF含量1-4倍。小动物活体成像结果表明化疗药物可以提高Ad5-RFP在活体肿瘤内的基因表达水平。【结论】化疗药物可显著提高2型腺相关病毒载体和复制缺陷型腺病毒载体对多种肿瘤细胞的转导效率和外源基因表达水平,使外源基因快速、高效的在靶细胞内表达。化疗药物可能是在转录水平上提高rAAV2和Ad5介导的基因的表达的。
目的在建立二亚硝基哌嗪诱导气虚体质状态大鼠鼻咽黏膜上皮细胞癌变模型基础上,应用益气解毒方干预模型大鼠,研究“气虚染毒”病机与鼻咽上皮细胞癌变启动和发展过程中细胞凋亡活性异常改变的相关性及其信号传导机理,确定不同凋亡信号传导通路中的关键基因；探讨益气解毒方诱导鼻咽上皮癌变细胞凋亡信号传导的主要通路及其主要环节相关责任基因的表达调控和干预靶点,验证对应性治疗法则“益气解毒”对“气虚染毒”病机所诱发鼻咽上皮细胞癌变病程的阻逆效应。

通常 方法研究工作分两步进行。 1.二亚硝基哌嗪诱发力竭游泳大鼠鼻咽上皮细胞癌变(“气虚染毒”)的细胞凋亡信号传导通路研究健康雄性SD大鼠56只,随机分为模型组Ⅰ24只,模型组Ⅱ24只和空白对照组8只。模型组Ⅰ腋部皮下注射二亚硝基哌嗪(DNP)和氟波酯(TPA),模型组Ⅱ于进行力竭游泳的同时同组Ⅰ注射DNP和TPA,空白组同法注射用生理盐水稀释10倍的二甲基亚砜(DMSO),共注射28次。实验周期最长达到400天。定期分批处死大鼠,取鼻咽组织进行鼻咽癌变诱发过程中各阶段的病理组织学检查,以TUNEL法检测各阶段组织标本细胞凋亡活性,应用免疫组织化学SABC法检测各组织标本PCNA指数、细胞凋亡信号传到通路线粒体途径(Bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase-3)及NF-κBp65信号传导途径(NF-κBp65和IκB)的主要相关蛋白活性表达,并应用RT-PCR技术检测Bcl-2和Bax mRNA的表达,以验证相关指标免疫组化检测结果。 2.