651,P<0.001、P<0.001、P<0.001和P<0.001和P
目的 1.建立稳定有效的脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外培养方法,比较原代人脐静脉内皮细胞与人脐静脉内皮细胞株HUVEC-CS及EA.hy926的VWF、CD31、CD34表面抗原表达情况。

2.采用过氧化氢(H202)体外诱导培养法,构建HUVECs氧化应激模型。观察体外正常培养HUVECs Visfatin的表达及氧化应激损伤对其表达的影响。 3.观察Visfatin对体外正常培养及氧化应激损伤HUVECs的凋亡及多种细胞因子表达的影响,探讨其发挥效应的可能信号通路。 4.探讨血浆Visfatin的影响因素及其与冠心病、糖代谢异常的相关性。应用eZscan系统和实验室方法对冠心病患者进行糖代谢异常的筛查,探讨eZscan系统的临床应用价值和前景。 方法 1.用0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离原代人HUVECs,加入含内皮细胞生长因子的M199完全培养基内培养,]HUVEC-CS及EA.hy926细胞株用DMEM完全培养基培养。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代,三种细胞在倒置相差显微镜下观察形态学,免疫荧光染色法测定VWF表达,流式细胞仪检测CD31、CD34表面抗原表达。 RAD001数据表 2.①体外培养的人脐静脉内皮细胞株传代后进行实验,将实验细胞分为对照组、模型组,在剂量效应干预中,模型组分为6个不同浓度梯度(H202终浓度分别为100、200、400、600、800、1OOOμmol/L),筛选H202最佳作用浓度；在时间效应干预中,以筛选出的H202最佳作用浓度分别培养细胞6、12、24h,筛选最佳作用时间。收集各组细胞进行相关检测：倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态学变化；采用细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测细胞存活率；DCFH-DA荧光探针和流式细胞技术(FCM)检测细胞内活性氧水平；流式细胞技术TUNEL法检测细胞凋亡率和增殖指数。②体外培养的人脐静脉内皮细胞株传代后进行实验,将实验细胞随机分为正常对照组和H202处理组(H202终浓度分别为50、100、200、400、1000μmol/L),培养1、2、4、24h分别进行检测。Vestern

blot检测visfatin蛋白水平的变化,Real time PCR测定Vistafin基因表达。 3.体外培养的人脐静脉内皮细胞株传代后进行实验,将实验细胞随机分组后予Visfatin、SB203580、LY29004相应干预处理,流式细胞仪TUNEL法检测细胞凋亡率和细胞周期,ELISA定量检测IL-6、MCP-1、VCAM、VEGF、iNOS浓度。 4.选取160例冠心病患者,根据患者是否合并糖代谢异常,将其分为冠心病合并糖代谢异常组及单纯性冠心病组；同期选择无器质性心脏病的糖代谢异常患者50例；同期选取50例健康人群作为正常对照组。空腹测定所有受试者实验室指标及血浆Visfatin水平,并进行baPWV及ABI检测,应用eZscan系统(糖尿病及并发症风险早期检测系统)对经冠脉造影确诊的冠心病患者进行糖代谢异常筛查,并将检测结果与实验室检查结果进行比较,评价其灵敏度和特异度。 结果 1.①原代HUVECs在接种24h后完全贴壁生长,呈多角形,单个或成团存在,4-5天后融合呈铺路石样镶嵌排列。HUVEC-CS和EA.hy926细胞为圆形或扁平形,生长速度快,2天左右即可铺满,融合后呈典型的“鹅卵石”状排列。②原代HUVECs及EA.hy926细胞的VWF免疫荧光染色呈阳性反应,大部分细胞内可见绿色荧光,HUVEC-CS细胞则染色呈阴性。HUVEC-CS细胞CD31阳性表达率(%)(4.70±0.46)显著低于原代HUVECs 不 (77.93±0.25)或EA.hy926细胞(78.23±0.40),差异均有统计学意义(P均0.05)。原代HUVECs CD34阳性表达率(%)(43.1±0.20)显著高于HUVEC-CS细胞(1.20±0.40)或EA.hy926细胞(0.97±0.40),差异均有统计学意义(P均0.05)。 NU7441 2.①与正常组比较,H202模型组HUVECs细胞形态学明显改变,细胞体积缩 小,胞膜皱缩,细胞轮廓不清,形状不规则,细胞排列紊乱,部分细胞上浮,典 型单层铺路石样细胞排列受到不同程度的破坏。梭型细胞减少,出现球形或椭圆形细胞,球形或椭圆形细胞数量随作用时间延长和剂量增加而增多,表明H202对HUVECs具有损伤作用。CCK-8显示随着H202作用浓度的增加和时间的延长,HUVECs存活率逐渐下降,呈现一定的量效和时效关系。DCFH-DA荧光探针和流式细胞技术(FCM)检测H202模型组细胞内有较高的活性氧水平。流式细胞技术TUNEL法观察证实H202能够诱导HUVECs发生凋亡,随着H202作用浓度的增加细胞凋亡率明显增加。②体外正常培养的HUVECs表达Visfatin。予不同浓度H202(50、100、200、400、1000μmol/L)作用HUVECs不同时间(1、2、

4、24h),结果发现,在低浓度H202(50、100μmol/L)作用时,Visfatin的表达随H202作用时间延长而增加(P<0.05),但H202作用时间延长后(≥4h),随H202作用浓度增加Visfatin的表达减少(P0.05)。不同浓度Visfatin处理正常培养细胞24h/48h后,IL-6,MCP-1, VCAM, VEGF, iNOS表达较正常对照组均增加(P均<0.001),但3种浓度Visfatin处理组间两两比较,随着Visfatin浓度递增,细胞凋亡率反而逐渐增加,任意两组间均有统计学差异(P<0.05)。Visfatin预处理细胞24h后,氧化应激损伤HUVECs的增殖指数较H202对照组上升,差异有统计学意义(P0.05)。Visfatin100ng/ml、400ng/ml、800ng/ml预处理细胞48h不同处理组的细胞增殖指数较H202对照组上升,差异有统计学意义(P0.05),各细胞因子表达随Visfatin浓度升高而增加,差异均有统计学意义(P<0.05),经两两比较,各细胞因子表达随Visfatn浓度升高而增加,任意两组间差异均有统计学意义(P<均0.05),除MCP-1外,这2种不同的通路抑制剂的作用差异具有统计学意义,p38MAPK抑制剂的作用更为显著(P<0.05)。冠心病不同临床类型(慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性心肌梗死)血浆Visfatin水平递增性升高(P<0.05),冠心病合并糖代谢异常患者Visfatin显著高于未合并糖代谢异常冠心病患者(P<0.