25ng/ml～2000ng/ml),并作标准曲线(结果呈线性关系)。从标准曲线上计算样品浓度,定量每份脑组织抽提液的EB量。再与组织的质量相比,得到每克脑组织的EB含量。 冰冻切片：灌注后,取一半大脑,快速进行冠状冰冻切片,8μm,隔4取1。避光晾干,用50%甘油-PBS封片。显微镜蓝色激发光下观察并拍片。 4. Western Blot检测脑血管内皮细胞moesin及其磷酸化水平 将小鼠麻醉后作打开颅腔,取脑,冰上去除软脑膜和白质。将剩余脑组织放入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液中,用组织匀浆机冰上匀浆共10 min,分三次,每次间隔1分钟。然后冰上静置裂解60min,离心取上清,采用Bradford法测定蛋白浓度。蛋白变性后采用Tris／甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法获得印迹膜,将用二抗结合后的印迹膜放入TBST中漂洗3×5 min后,滤纸小心吸干膜上液体,在膜上加适量配制好的ECL发光底物(Amersham,美国),使其于印迹膜充分作用接触,吸去多余液体,于柯达2000工作站曝光显影保存。 5.免疫组化分析各器官组织血管内皮细胞noesin及其磷酸化水平 将小鼠各器官组织取出,经固定后石蜡包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复后采用两步法检测各器官组织血管内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化的水平,在400倍光镜下观察并拍片。利用Leaca

Q500MC软件获取灰度值并进行统计。 抑制剂 6.免疫荧光分析脑血管内皮细胞moesin及其磷酸化水平 将小鼠各器官组织取出,经固定后石蜡包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复后,用荧光二抗进行孵育检测各器官组织血管内皮细胞moesin蛋白及其磷酸化的水平,在1000倍油镜下观察、拍片。利用Leaca

Q500MC软件获取灰度值并进行统计。 结果 1 AGE-MSA对小鼠血脑屏障通透性的影响及机制 1.1 AGE-MSA对血脑屏障通透性的影响 对照组伊文思蓝的渗出量是0.809-0.045(μg/g脑组织),AGE-MSA组伊文思蓝的渗出量是1.224±0.072(μg/g脑组织),AGE-MSA组血脑屏障伊文思蓝的渗出量较对照组显著增多(P0.05)。提示AGE刺激引起了moesin磷酸化水平显著增高。 还有 免疫组化和免疫荧光结果显示：AGE-MSA组脑微血管内皮细胞的phos-moesin染色程度(与moesin比较)较对照组强,提示其磷酸化水平增加。 2 AGE-MSA诱导的脑微血管内皮细胞moesin磷酸化的上游信号通路研究 2.1抑制p38 MAPK通路对AGE-MSA介导的moesin磷酸化的影响 结果显示,与对照组相比,AGE-MSA刺激的小鼠脑微血管细胞p38 MAPK的磷酸化水平显著提高(P<0.05)；SB203580+AGE-MSA组的phos-p38水平较单纯AGE-MSA刺激组显著降低(P<0.05)；预先给予p38MAPK抑制剂或ROCK抑制剂的小鼠各组织器官内皮细胞磷酸化moesin虽然比对照组略微显著,但可见其组化染色深度显著低于单纯AGE-MSA刺激组(P
目的：重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一种临床常见的危重急腹症。其发病急骤,病情复杂,易出现多种并发症,预后较差,死亡率可高达20%以上。但其发病机制尚不清楚,仍缺乏特异有效的药物治疗。近年来研究得出在SAP的发生发展中信号传导通路中的各种细胞因子相互作用,产生大量各种炎性因子,进而引起全身炎症反应综合征(systemic 获悉更多 inflammation response syndrome,SIRS),最终可导致多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF)。如何才能有效调控细胞因子的产生,防止SIRS的发生或减轻其严重程度,从而提高SAP的治疗效果并降低死亡率成为摆在广大医学工作者面前的一道巨大的难题。已经证实p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信号传导通路与多种细胞因子产生与调控密切相关,因而本课题利用大鼠牛黄胆酸钠(sodium taurocholate, Tc-Na)重症急性胰腺炎模型对此通路进行研究,探讨p38MAPK抑制剂SB203580在重症急性胰腺炎大鼠模型中的作用机制。方法：将45只成年雄性SD大鼠随机分为三组,假手术组(SO组)、SAP组及SB203580治疗组(SB组)。用5%Tc-Na (1ml/kg)胆胰管逆行注射建立SAP模型。大鼠术前12h禁食不禁水,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(1ml/kg),常规消毒铺巾,上腹部正中切口2cm入腹。加工钝头的1ml注射器针头于十二指肠乳头附近穿刺十二指肠降部外侧壁,自十二指肠乳头逆行刺入胰胆管末端约1cm,在近肝门处用无损伤性小动脉夹夹闭胰胆管近肝门端,注入5%Tc-Na(注射速度0.1ml/min),注完后5min检查并确认大鼠局部胰腺组织出现充血后拔出注射针,松开动脉夹,确认腹腔无活动性出血后两层关腹,背部皮下注射生理盐水(2ml／100g)以补充术中丢失水分。SB组大鼠在术前30分钟尾静脉注射SB203580

(5mg/kg)。每组15只分3h,6h,12h三个时间点,每个时间点5只。开腹观察胰腺变化,测腹水变化情况,心脏采血约3-5ml,提取血清,血清样本保存于-20℃,以备后续检测。取胰头部组织,用4%多聚甲醛浸入固定24h,石蜡包埋、切片。各组大鼠放血致死后取肺组织置80℃烤箱连续烘烤24h,计算其湿／干比值。全自动血生化分析仪检测血清淀粉酶并采用ELISA法测定血清TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子。肉眼观察胰、肺组织出血、水肿等变化；HE染色,光镜观察胰腺组织病理学改变；并采用免疫组化SP法观察ATF2磷酸化表达情况并计数阳性细胞数。结果：1.腹水：SO组无血性腹水；SAP组、SB组均有血性腹水,各时间点SB组腹水量低于SAP组,有统计学意义(p<0.01)。2.血清淀粉酶：SO组血清淀粉酶活性较低,各时间点均低于其它两组(p<0.01)；SB组各组水平较SAP组降低,但只在6h、12h有统计学意义(p<0.01)。3.血清细胞因子：SO组血清TNF-α、IL-6和IL-10浓度显著低于SAP组和SB组,有统计学意义(p<0.01)；SB组TNF-α、IL-6和IL-10浓度低于SAP组,TNF-α、IL-10各时间点均有统计学意义(p<0.05)；.IL-6在6h、12h有统计学意义(p<0.05)。4.肺的湿／干重比值：SO组各时间点比值低于SAP组和SB组,有统计学意义(P<0.