4.转染miR-125b反义核酸的骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表达量升高。 结论：STAT3是miR-125b的靶基因,miR-125b通过结合STAT3的3′UTR区抑制靶基因STAT3的表达。 第三节STAT3对miR-125b的转录激活作用 目的：探讨STAT3作为重要的转录因子能否转录激活miR-125b。 方BAY 73-4506体内法： 1.我们首先采取CONSITE和PromoterInspector软件分析预测成熟miR-125b在人基因组上的两个基因位点上游的10kb序列,分别是11号染色体上的miR-125b-1,21号染色体上的miR-125b-2。找到潜在的启动子区域。 2.构建荧光素酶表达载体将miR-125b-1前体5’端不同Doxorubicin长度片段(-1600to-900bp,-1400to-900bp,-1175to-900bp)序列克隆至PGL3载体。再转染到骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中,转染48小时后收取细胞,本实验采取双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶(Renilla)作为内参,检测萤火虫荧光素酶(Firefly)的活性。最终以二获悉更多者的比值作为相对表达量数值(Firefly/Renilla)。 3.我们选用MatInspector软件对启动子区域的顺式作用元件进行分析,找出可能存在的转录因子结合位点。 4.采取点突变的办法使-1175to-900bp序列中潜在的STAT3结合序列、STAT6结合序列和CAAT序列发生碱基突变,构成PGL3-mSTAT3,PGL3-mSTAT6和PGL3-mCAAT突变荧光素酶报告基因质粒。