Thomas停跳液后缺血40min,复灌K-H液60min；IPO组：灌注4℃ST.Thomas停跳液后缺血40min,于复灌开始前予以复灌K-H液10s、停灌10s的循环6次,续灌K-H液58min; 5-HD+IPO组：灌注4℃ST.Thomas停跳液后缺血40min,行5-羟葵酸灌注5min,继以K-H液复灌10s、停灌10s循环6次,续灌K-H液53min。观察并记录各组平衡末和续灌末心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVDEP)、以及最大dp/dt等心功能的变化。 寻找更多 2.以差速离心法及Nycodenz密度梯度离心法提取、纯化大鼠心肌线粒体,并以Western blot法验证其纯度。 3.按照2中方法获取纯化的心肌线粒体；提取各组线粒体蛋白并行纯化后定量；采用Cydye染料对各组荧光标记后行2D-DIGE分离。采用DeCyder V6.0软件分析对比组差异表达蛋白点并将差异蛋白质斑点进行全自动斑点处理工作站处理；最后进行MALDI-TOF-MS鉴定和数据检索。 结果： 1.平衡末各组间心功能无明显差异；续灌末Nor,
IPO组心功能显著优于Con组,5-HD+IPO组与Con组比较心功能无明显差异。 2.采用Nycodenz不连续密度梯度离心法提纯了大鼠心肌线粒体,并以Western blot法证实了所获线粒体纯度较高。 3.对各组进行2D-DIGE,得到聚焦良好、相似性高的图谱,在各组胶上平均检测出752±49个蛋白斑点；各组分析鉴定后得到28个较好的差异蛋白点图谱,本研究重点关注其中差异1.5倍以上的5个蛋白。 4.(1)Nor和Con组比较鉴定出：spot554 (NDUFA10, NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 10, mitochondrial; NADH脱氢酶亚基)表达水平降低3.84倍；spot555 (rCG55630,isoform CRA,推测为NADH脱氢酶亚基)表达水平降低3.76倍。 (2)IPO和Con组比较鉴定出：spot554(NDUFA10)、spot254(SDHA, Succinate dehydrogenase [ubiquinone]
flavoprotein subunit, mitochondrial;琥珀酸脱氢酶—黄素蛋白)两种蛋白表达水平显著分别降低3.33倍、1.68倍；spot645 (CoQ9,合成CoQ的必须酶)表达水平降低3.43倍、spot648 (CoQ9)表达水平升高2.42倍。 (3) 5-HD+IPO和IPO组比较鉴定出：spot254 (SDHA)表达水平升高1.65倍。 结论： 1.缺血后处理能改善大鼠心脏功能；而5-羟葵酸拮抗缺血后处理能抑制缺血后处理改善心功能的作用。 2. Nycodenz不连续密度梯度离心法可获得纯度较高心肌线粒体。 3.(1)心肌缺血再灌注损伤影响NDUFA10的活性。 (2)缺血后处理可维持线粒体NADH呼吸链稳定。 selleck (3) SDHA和线粒体敏感性K+通道(mitoKATP)存在着密切的关系；两者相互作用共同参与了缺血后处理内源性保护机制。 (4)缺血后处理用于缺血再灌注心肌时可能造成CoQ9发生剪切或修饰。
研究背景:在许多有活性的羰基化合物和糖化终末产物(AGEs)的前体中,甲基乙二醛(MG)可能对细胞内的AGEs的形成起着关键作用。以前的研究已经报道AGEs与阿尔茨海默病(AD)的发病机制有关,即与由异常磷酸化的tau聚合而成的神经原纤维缠结(NFTs)的形成有关。研究报道AD患者体内的MG水平是正常人体内的两倍,而其在脑脊液的浓度是血浆中的五到七倍。MG的特异清除酶——乙二醛酶I(Glyoxalase I)的表达在AD的早期阶段有减少,而在AD的中末期有增加。另外有研究证明乙二醛酶I在tau的转基因小鼠P301L中有明显的升高,这表明MG与tau之间有联系。而细胞内的AGEs与PHF-tau共定位,AGEs和糖化的tau蛋白培养可以诱导氧化应激并最终导致神经功能障碍和细胞死亡,暗示了AGEs和tau之间有某种内在联系。我们推测,MG作为AGEs重要的高活性的前体,可能是AD的tau病理性改变重要的上游致病因素之一。因此,探明其在tau蛋白异常磷酸化中的机制,对进一步理解AD和寻找新的防治途径具有重要意义。
目的:探讨MG对tau蛋白磷酸化的影响及其作用机制。 方法:用不同浓度的MG处理SK-N-SH细胞不同时间,观察在不影响细胞活性的MG浓度和处理时间的条件下,通过western blotting和免疫荧光等方法检测经MG处理后的细胞,tau蛋白磷酸化变化模式,并探讨tau磷酸化相关的蛋白激酶和磷酸酶活性及其在tau磷酸化中的作用;使用相关激酶的抑制剂和氨基胍阐明MG影响tau蛋白异常磷酸化的可能机制。 结果: 1.用不同浓度的MG处理SK-N-SH细胞1小时,或者用1.0 mM浓度的MG处理细胞不同时间,发现用少于5 mM的MG处理细胞1小时或者用1 mM的MG处理细胞时间低于4小时对细胞的活性无明显影响。 2.用不同浓度的MG分别处理细胞1小时,或者用1.0 mM浓度的MG处理细胞不同小时,可以观察到MG能够诱导tau在许多不同位点磷酸化。 3. GSK-3β和p38在MG诱导的tau异常磷酸化中激活。 4. JNK,Erk1/2,cdk5在MG诱导的tau异常磷酸化中不起作用。 5. PP2A的活性在MG诱导的tau异常磷酸化中未改变。 6.使用GSK-3β和p38的抑制剂能够减弱MG诱导的tau的异常磷酸化。 7.使用氨基胍(AG)处理细胞,能够改善MG引起的tau的异常磷酸化。 并且 结论:MG能够引起SK-N-SH细胞中tau蛋白的磷酸化,这可能是通过调节GSK-3β和p38,而氨基胍可以逆转tau蛋白的磷酸化。
目的: 制作大鼠四动脉结扎(four-vessel occlusion, 4-VO)全脑缺血(global cerebral ischemia, GCI)模型,研究延迟性脑缺血后处理(delayed ischemic postconditioning, PostC)介导的Akt/GSK3β信号通路对大鼠缺血性神经元损伤的保护作用及抗线粒体凋亡机制。 方法: 1. SPF级成年雄性SD大鼠,体重250～300 g,制作四动脉结扎全脑缺血模型,缺血8 min。实验动物随机分为:假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、延迟性脑缺血后处理组(PostC组)、溶剂对照组(PostC + Vehicle组)、抑制剂组(PostC + LY294002组)。假手术组仅暴露双侧颈总动脉,但不进行缺血;缺血再灌注组暴露双侧颈总动脉并夹闭8 min;延迟性脑缺血后处理组于缺血8 min后,再灌注48 h后行二次缺血3 min,溶剂对照组及抑制剂组分别在二次缺血前20 min脑室注射DMSO及LY294002。实验分组和流程如Fig. 1所示。 2.